Análisis del microbioma endófito de maca (Lepidium meyenii) y su influencia en el catabolismo de glucosinolatos para la formación de macamidas y bencenoides en el secado postcosecha tradicional

Abstract

La maca (Lepidium meyenii, Brassicaceae) es una planta herbácea anual nativa de la región central de los Andes peruanos. Desde tiempos precolombinos, sus hipocótilos secos han sido valorados por sus propiedades nutricionales y medicinales. Los agricultores locales tradicionalmente exponen los hipocótilos a condiciones extremas a gran altitud (4200 m.s.n.m.) para un secado prolongado al aire libre, un proceso postcosecha considerado esencial para la acumulación de macamidas, metabolitos bioactivos asociados a efectos estimulantes del sistema nervioso central. Las macamidas son el producto de condensación de la bencilamina, derivada del catabolismo de glucosinolatos, con ácidos grasos libres liberados por la hidrólisis de lípidos. Sin embargo, la bencilamina puede seguir una vía alternativa dependiente de la deshidratación del hipocótilo, que conduce a benzaldehído, bencilalcohol y ácido benzoico. Este último es particularmente relevante para la exportación de la maca, ya que su concentración está regulada en ciertos mercados internacionales. Si bien los precursores y productos de este proceso han sido cada vez más documentados, los factores bioquímicos moduladores aún permanecen poco comprendidos. La presente tesis investiga la asociación entre los ensamblajes microbianos endófitos y los cambios en el perfil metabólico de los hipocótilos durante ocho semanas de secado postcosecha tradicional en Junín, Perú. La cinética de los metabolitos se caracterizó mediante LC-DAD y GC-MS, enfocándose en bencilglucosinolato, bencilisotiocianato, bencilamina, ácidos grasos libres (palmítico, esteárico, oleico, linoleico y linolénico), sus correspondientes macamidas (sintetizadas en el laboratorio), y ácido benzoico libre y conjugado. También se monitorearon compuestos volátiles como bencilalcohol, bencilnitrilo y benzaldehído. La diversidad microbiana endófita en los hipocótilos y del suelo de cultivo se evaluó mediante secuenciación NGS de amplicones del gen 16S rRNA (V4-V5), utilizando un protocolo de extracción de ADN adaptado y optimizado que incluyó un pretratamiento del tejido interno con α-amilasa. El análisis cinético, dividido en tres ventanas temporales, mostró que durante el periodo de 14- 30 días de secado tradicional ocurre la mayor hidrólisis del stock de bencilglucosinolato, siendo la humedad residual el factor físico condicionante. Se observó una acelerada formación y acumulación de bencilamina, con perfiles bastante coincidentes con la caída de bencilglucosinolato, el aumento tardío de bencilnitrilo, la producción continua de benzaldehído y ácidos grasos, y la acumulación de bencilalcohol y ácido benzoico en formas conjugadas. Se evidenció que las macamidas son un producto tardío y de menor abundancia del catabolismo de glucosinolatos, por lo que constituyen un sumidero secundario de la redistribución del pool bencílico a lo largo del tiempo de secado en campo. Las familias bacterianas Enterobacteriaceae y Streptomycetaceae fueron las más abundantes en la maca, manteniendo una diversidad y estructura comunitaria relativamente estables en el tiempo. Estas familias fueron coincidentes con las encontradas también en el suelo de cultivo, por lo que el suelo andino constituiría la principal fuente de microorganismos que colonizan la endosfera de la maca. La elevada abundancia de Enterobacteriaceae se corresponde con la capacidad de algunos de sus miembros de expresar enzimas con actividad tipo mirosinasas, las cuales puedan contribuir a la hidrólisis del bencilglucosinolato. Además, se propone que podrían participar de la conversión del bencilisotiocinato, producto predilecto y muy reactivo de la hidrólisis por encima de bencilnitrilo, hacia la acumulación de bencilamina, mediada por posibles isotiocianato hidrolasas, previamente reportadas para especies de esta familia. Los hallazgos de este estudio aportan nuevas perspectivas sobre cómo las comunidades endófitas podrían influir en el perfil fitoquímico de la maca, favoreciendo a la formación del principal precursor de las macamidas.Maca (Lepidium meyenii, Brassicaceae) is an annual herbaceous plant native to the central region of the Peruvian Andes. Since pre-Columbian times, its dried hypocotyls have been valued for their nutritional and medicinal properties. Local farmers traditionally expose the hypocotyls to extremely high-altitude conditions (4200 m.a.s.l.) for prolonged open-air drying, a postharvest process considered essential for the accumulation of macamides, bioactive metabolites associated with stimulatory effects on the central nervous system. Macamides are formed through the condensation of benzylamine, derived from glucosinolate catabolism, with free fatty acids released by lipid hydrolysis. However, benzylamine may follow an alternative pathway dependent on hypocotyl dehydration, leading to the formation of benzaldehyde, benzyl alcohol, and benzoic acid. The latter is particularly relevant for maca export, as its concentration is regulated in certain international markets. Although the precursors and products of this process have been increasingly more documented, the biochemical factors modulating these transformations remain poorly understood. This thesis investigates the association between endophytic microbial assemblages and the changes in the metabolic profile of maca hypocotyls throughout the eight weeks of traditional postharvest drying in Junín, Peru. Metabolite kinetics were characterized by LC–DAD and GC–MS, focusing on benzylglucosinolate, benzyl isothiocyanate, benzylamine, free fatty acids (palmitic, stearic, oleic, linoleic, and linolenic acids), their corresponding macamides (synthesized in the laboratory), and free and conjugated benzoic acid. Volatile compounds such as benzyl alcohol, benzonitrile, and benzaldehyde were also monitored. Endophytic microbial diversity in hypocotyls and cultivation soils was assessed by NGS amplicon sequencing of the 16S rRNA gene (V4–V5 regions), using an adapted and optimized DNA extraction protocol that included a pre-treatment of internal tissues with α-amylase. Kinetic analysis, divided into three temporal windows, showed that the greatest hydrolysis of the benzylglucosinolate pool occurs during the period of 14-30 days of traditional drying, with the residual moisture acting as the main conditioning physical factor. A rapid formation and accumulation of benzylamine was observed, with kinetic profiles closely matching the decline in benzylglucosinolate, along with a delayed increase in benzonitrile, continuous production of benzaldehyde and free fatty acids, and accumulation of benzyl alcohol and benzoic acid in conjugated forms. These results indicate that macamides are late-formed and low-abundance products of glucosinolate catabolism and therefore constitute a secondary sink in the redistribution of the benzyl pool throughout the field drying period. The bacterial families Enterobacteriaceae and Streptomycetaceae were the most abundant in maca hypocotyls, maintaining relatively stable diversity and community structure over time. These families were also detected in cultivation soils, suggesting that Andean soil represents the primary source of microorganisms colonizing the maca endosphere. The high abundance of Enterobacteriaceae is consistent with the ability of some of its members to express enzymes with myrosinase-like activity, which may contribute to benzylglucosinolate hydrolysis. In addition, these bacteria are proposed to participate in the conversion of benzyl isothiocyanate, the predominant and highly reactive hydrolysis product relative to benzonitrile, toward benzylamine accumulation, potentially mediated by isothiocyanate hydrolases previously reported in species of this family. The findings of this study provide new perspectives on how endophytic communities may influence the phytochemical profile of maca, favoring the formation of the main precursor of macamides.