PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL PERÚ Facultad de Ciencias e Ingeniería Vanilla pompona (Orchidaceae), especie de orquídea de los humedales de Madre de Dios: cuantificación por HPLC de la Vainillina y otros componentes aromáticos Tesis para optar el título de: Licenciada en Química Presentada por: Angelica Mariko Naka Kishimoto LIMA – PERU 2008 RESUMEN Las vainas de vainilla, debido a su refinado sabor y apreciado aroma, se utilizan desde hace mucho tiempo para aromatizar alimentos, especialmente postres y bebidas. El extracto de vainas de vainilla es una mezcla extremadamente complicada de cientos de compuestos diferentes, entre los que se encuentran alcoholes, ácidos, ésteres, éteres, terpenoides, entre otros. De todos ellos, la vainillina (4-hidroxi-3- metoxibenzaldehído) es el componente mayoritario y el principal responsable del característico aroma y sabor del extracto. En el mercado, se comercializa tanto vainas de vainilla curadas como extracto de vainas de vainilla. Sin embargo, debido a que éstas no pueden cubrir la gran demanda (más de 12 000 toneladas anuales), existe también la esencia sintética, de muy bajo precio, pero que consiste únicamente en una solución etanólica de vainillina. La desventaja de esta esencia es que no posee todos los componentes de aroma y sabor característicos del extracto de vainas de vainilla. Dada la gran demanda actual de vainillina y las ventajas que ofrece el extracto natural, surgió el interés en evaluar el perfil aromático de Vanilla pompona, especie poco estudiada pero abundante en los humedales del departamento de Madre de Dios. Diversos extractos de vainas de Vanilla pompona, preparadas por hidrólisis enzimática (empleando Viscozima y Celuclast), fueron analizados mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Se cuantificó el contenido de alcohol p- hidroxibencílico, alcohol-4-hidroxi-3-metoxibencílico, ácido p-hidroxibenzoico, p- hidroxibenzaldehído, ácido vainíllico y vainillina. El perfil aromático de Vanilla pompona se comparó con el de la vainilla de Madagascar (Vanilla planifolia) obtenida comercialmente, especie muy importante a nivel internacional. AGRADECIMIENTO Deseo expresar mi agradecimiento a quienes me apoyaron para la realización de este trabajo de investigación. A mi asesora, Dra. Helena Maruenda, por haberme guiado con su compañía durante el desarrollo del presente estudio. Su gran nivel de exigencia, sus oportunos consejos y su insistencia para no perder el entusiasmo me han permitido concluir con éxito este trabajo de investigación. A John Janovec y su equipo de investigación por haber proporcionado las vainas de Vanilla pompona y facilitado datos de la investigación realizada por él y sus colaboradores en los humedales de Madre de Dios. A los profesores de la Sección Química, por la formación que recibí a lo largo de estos cinco años, en especial al Dr. Javier Nakamatsu por los momentos de conversaciones químicas, académicas y de la vida que me ayudaron a continuar con alegría mis estudios. Al personal no docente de la Sección Química, por las facilidades prestadas con total desprendimiento. A mis compañeros de laboratorio, por el independiente tiempo compartido bajo el sueño común de la finalización de nuestros respectivos trabajos de investigación. Y de manera especial a mis padres y hermanas por haberme brindado su ayuda, cariño y comprensión que fueron la fuerza necesaria para iniciar, desarrollar y culminar la tesis. ÍNDICE GENERAL Página 1 LA VAINILLA .................................................................................................. 1 1.1 Especies de vainilla ........................................................................................ 4 1.2 El fruto de la vainilla: descripción y composición química .............................. 8 1.3 Biosíntesis de compuestos del fruto de vainilla .............................................. 11 1.4 Maneras de sustituir a la vainilla natural ......................................................... 14 2 DETERMINACIÓN DEL PERFIL AROMÁTICO DEL FRUTO DE LA VAINILLA ........................................................................................................ 18 2.1 Proceso de curado de la vainilla ..................................................................... 18 2.2 Extracción de los componentes del fruto de la vainilla ................................... 21 2.2.1 Extracción a partir de vainas curadas .............................................. 21 2.2.2 Extracción a partir de vainas frescas ............................................... 22 2.3 Cuantificación de los componentes del fruto de la vainilla mediante HPLC ............................................................................................................... 26 3 PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................... 28 3.1 Equipos y Materiales ....................................................................................... 28 3.2 Metodología .................................................................................................... 30 3.2.1 Medición de actividad β-D-glucosidasa de las enzimas ................... 30 3.2.2 Determinación de humedad ............................................................. 31 3.2.3 Extracción de los componentes de vainilla ...................................... 31 3.2.4 Cuantificación de los componentes del extracto mediante HPLC ................................................................................................ 33 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 34 4.1 Actividad β-D-glucosidasa de las enzimas ..................................................... 34 4.2 Humedad de los frutos de Vanilla pompona y de Vanilla planifolia ................ 38 4.3 Análisis y cuantificación por HPLC ................................................................. 38 4.4 Hidrólisis enzimática y determinación del perfil aromático ............................. 46 5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................. 52 6 REFERENCIAS .............................................................................................. 54 7 ANEXOS ......................................................................................................... 60 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1: Polinización manual de la vainilla ....................................................... 3 Figura 2: Distribución de las especies de Vanilla en el Perú: Vanilla hamata, Vanilla pompona, Vanilla planifolia (Loreto: Maynas), Vanilla ruiziana, Vanilla weberbaueriana (Amazonas: Río Cenepa, Yamayakat) ................................................ 7 Figura 3: Vanilla pompona Schiede subsp. grandiflora (Lindl.) Soto- Arenas ................................................................................................. 8 Figura 4: Algunos componentes del extracto de vainilla .................................... 9 Figura 5: Ruta biosintética de los componentes de la vainilla ............................ 12 Figura 6: Algunas de las principales fuentes de vainillina .................................. 15 Figura 7: Producción biotecnológica de la vainillina ........................................... 16 Figura 8: Ubicación de vainillina y glucovainillina dentro del tejido celular. Concentración de glucovainillina y actividad de la enzima β-D-glucosidasa en las diferentes zonas ............................... 23 Figura 9: Método del ácido 3,5-dinitrosalicílico para cuantificar glucosa liberada luego de la hidrólisis de la celobiosa por acción de las glucosidasas .................................................................................. 25 Figura 10: Proceso completo (extracción, separación y cuantificación) para la determinación del perfil aromático de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios ................................... 27 Figura 11: Espectro UV-VIS del ácido 3,5-dinitrosalicílico ................................... 34 Figura 12: Curva estándar de la glucosa .............................................................. 35 Figura 13: Actividad de Viscozima empleando celobiosa como sustrato ............. 36 Figura 14: Actividad de Celuclast empleando celobiosa como sustrato ............... 37 Figura 15: Espectro UV del alcohol p-hidroxibencílico en etanol (0.006 mg/mL) y del alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico en etanol (0.006 mg/mL) ..................................................................................... 39 Figura 16: Espectro UV del ácido p-hidroxibenzoico en etanol (0.006 mg/mL) y del p-hidroxibenzaldehído en etanol (0.006 mg/mL) ........... 40 Figura 17: Espectro UV del ácido vainíllico en etanol (0.006 mg/mL) y de la vainillina en etanol (0.006 mg/mL) .............................................. 40 Figura 18: Cromatograma del ácido p-hidroxibenzoico (tR = 10.89 min), p-hidroxibenzaldehído (tR = 12.47 min), ácido vainíllico (tR = 13.21 min) y vainillina (tR = 14.71 min), monitoreado a λ = 254 nm ................................................................................................ 41 Figura 19: Cromatograma de alcohol p-hidroxibencílico (tR = 5.29 min) y alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico (tR = 8.52 min), monitoreado a λ = 230 nm .................................................................. 42 Figura 20: Curva estándar del alcohol p-hidroxibencílico ..................................... 43 Figura 21: Curva estándar del alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico ...................... 43 Figura 22: Curva estándar del ácido p-hidroxibenzoico ........................................ 44 Figura 23: Curva estándar del p-hidroxibenzaldehído .......................................... 44 Figura 24: Curva estándar del ácido vainíllico ..................................................... 45 Figura 25: Curva estándar de la vainillina ............................................................ 45 LISTA DE TABLAS Página Tabla 1: Rangos actualizados de las razones en masa entre componentes aromáticos del fruto de la vainilla ................................. 10 Tabla 2: Procedimientos realizados para extraer los componentes de interés de la vainilla, con los distintos tipos de vainas ........................ 32 Tabla 3: Validación de la curva estándar de glucosa ........................................ 35 Tabla 4: Sistema de gradiente ácido fosfórico 0.001 M – metanol ................... 38 Tabla 5: Concentraciones teóricas y experimentales de los componentes de la vainilla para la validación de las curvas estándar .............................................................................................. 46 Tabla 6: Resultados de experimentos realizados para determinar la cantidad óptima de enzimas (Viscozima y Celuclast) a utilizar .................................................................................................. 47 Tabla 7: Perfil aromático de vainas de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios (inmaduras y maduras) y de vainas curadas de Vanilla planifolia obtenidas comercialmente ................................................................................... 48 Tabla 8: Relación entre los componentes de aroma y sabor (R1 – R5) de vainas de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios y de vainas de Vanilla planifolia curadas obtenidas comercialmente ................................................................................... 50 LISTA DE ABREVIATURAS HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución tR: Tiempo de retención LISTA DE ANEXOS Página Anexo 1: Lista de países importadores de vainilla en el año 2006 .............. 60 Anexo 2: Lista de países exportadores de vainilla en el año 2006 .............. 61 Anexo 3: Lista de países importadores de vainillina en el año 2006 ............ 62 Anexo 4: Lista de países exportadores de vainillina en el 2006 ................... 63 Anexo 5 – 24: Cromatogramas de los experimentos realizados con vainas de Vanilla pompona de prueba para determinar la cantidad óptima de enzimas a emplear y el tiempo necesario de incubación enzimática (extracción en medio acuoso) ............................................................................... 64 Anexo 25 – 28: Cromatogramas de los experimentos realizados con vainas de Vanilla pompona inmaduras (extracción en medio acuoso) ............................................................................... 84 Anexo 29 – 36: Cromatogramas de los experimentos realizados con vainas de Vanilla pompona de prueba (extracción etanólica y extracción Soxhlet por 7 horas) .................................. 88 Anexo 37 – 44: Cromatogramas de los experimentos realizados con vainas de Vanilla pompona maduras (extracción en medio acuoso y extracción Soxhlet por 24 horas) ........................ 96 Anexo 45 – 48: Cromatogramas de los experimentos realizados con vainas de Vanilla planifolia curadas obtenidas comercialmente en marzo del 2006 (extracción en medio acuoso).......................................................................................... 104 Anexo 49 – 52: Cromatogramas de los experimentos realizados con vainas de Vanilla planifolia curadas obtenidas comercialmente en setiembre del 2007 (extracción en medio acuoso) ............................................................................... 108 1 1 LA VAINILLA La vainilla (Orchidaceae: subtribu Vanillinae) es un arbusto herbáceo que pertenece a un género de orquídea que engloba a más de cien especies de plantas epífitas, hemiepífitas y terrestres (1). Las epífitas, a diferencia de las terrestres, son aquellas plantas que no han enraizado en el suelo, por lo que viven adheridas a troncos y ramas de otros árboles, pero sin parasitarlas (2). Las hemiepífitas son aquellas que en una etapa de desarrollo son estrictamente epífitas, pero que en otra puede llegar a producir raíces capaces de llegar al suelo y absorber de ella los nutrientes que necesita (3). La vainilla se cultiva entre 0 y 600 msnm, preferentemente en suelos arenosos y arcillosos, con buen drenaje natural y rico en materia orgánica (4, 5). Crece en zonas con climas cálidos, subtropicales y tropicales (4), cuyas temperaturas oscilan entre 20 y 30 ºC, tanto diurnas como nocturnas. Las precipitaciones deben ser abundantes y bien distribuidas (3 000 mm a lo largo de las estaciones) (6) y la humedad relativa debe ser inferior al 80% (7). La vainilla es una planta perenne (conserva sus tallos y hojas durante todo el año), de tallo flexible, cilíndrico, simple o ramificado (5), que puede llegar a alcanzar 100 metros de altura (8). Posee largas y fuertes raíces aéreas o adventicias que nacen de cada nódulo, con las que se fija en los troncos. Presenta hojas distribuidas de manera alterna a lo largo del tallo. Son oblongas, agudas en el ápice, sésiles, enteras, carnosas coriáceas, simples, de limbo ondulado y de color verde oscuro (4). Las flores de la vainilla son generalmente grandes (de 5 a 8 cm), fragantes y muy vistosas (4). Se presentan en inflorescencia o racimos y brotan de las axilas de las hojas; cada vainilla puede tener entre 10 y 15 racimos, compuestas por más de 10 flores individuales (5, 9). Estas flores presentan cáliz con tres sépalos coloreados; corola con tres pétalos blanco-verdosos: dos laterales y uno inferior denominado labelo (o pétalo modificado), que es de mayor tamaño y en forma de bolsa o saco (4, 9). Presenta uno, o raramente, dos estambres; el polen se encuentra reunido en polinias, formando una masa alargada y claviforme (4). Debajo de las anteras están los estigmas y entre éstos, por lo general, se encuentra una membrana más o menos prolongada llamada rostelo, que dificulta la autofecundación (4). 2 La fecundación de la flor de la vainilla puede ocurrir como consecuencia de la polinización natural o artificial. La fecundación natural ocurre a través de determinados insectos y colibríes. Este proceso es sumamente complicado porque está regido por un factor de casualidad y más aún por el hecho de que las flores solo permanecen abiertas durante ocho horas del día aproximadamente (5, 9, 10). Por ello, para asegurar la eficiencia en la fecundación de la vainilla es necesario polinizarla artificialmente, es decir, asistida por la mano del hombre. A partir de la flor fecundada, luego de unas cuatro o seis semanas, se desarrollan los frutos, que son unas vainas verdes, largas, gruesas, lisas y generalmente dehiscentes (se abren al madurar). Estas vainas deben permanecer en la planta entre ocho y nueve meses hasta alcanzar la madurez. Una planta de vainilla produce, con una manipulación adecuada, aproximadamente 150 vainas en cada cosecha (10). La vainilla es considerada como originaria de México (Veracruz). Los indígenas de Centroamérica (aztecas y mayas) la usaban desde épocas precolombinas (4). El pueblo Totonaca, en el antiguo México, figura en la historia como el mejor productor de vainilla. Ellos la cultivaban con devoción religiosa pues la consideraban un regalo de los dioses (8, 11). Las condiciones climáticas y geográficas adecuadas de esta zona de México, como altitud sobre el nivel del mar (500 metros), clima cálido húmedo, así como su técnica de polinización asistida, permitieron el desarrollo de la vainilla (11) e hicieron que México mantuviera el monopolio de la producción de frutos de vainilla hasta mediados del siglo XIX, con una producción no mayor a 2 toneladas (12, 6). Al llegar los españoles a México (1519) y luego de la conquista, la vainilla fue llevada a Europa (a Inglaterra y a los jardines botánicos franceses) y también a varias islas del Océano Índico, lugares en donde no se pudo obtener los frutos, a pesar de los esfuerzos realizados. Los primeros estudios científicos en torno a este problema fueron presentados en el año 1836 por un botánico belga llamado Charles Morren, quien realizó experimentos de fertilización con una vainilla que no había producido frutos por más de 15 años. Mediante un tratamiento especial de horticultura, Morren logró que la vainilla desarrollara 54 flores, las cuales luego fecundó manualmente y obtuvo el mismo número de frutos. Un año después, realizó el mismo procedimiento y obtuvo 100 frutos en una planta distinta. Los estudios de Morren confirmaron que para producir frutos, la vainilla debe tener por lo menos cinco o seis años de desarrollo y para 3 producir flores, se requería condiciones adecuadas de sombra, calor y humedad. El problema con el método de Morren es que la fecundación fue realizada con unas tijeras, con las que cortó el rostelo de la flor. Esta técnica resulta importante dentro del ámbito académico y en condiciones de invernadero pero no a gran escala (6). A finales del año 1841 y luego de 20 años de esterilidad, la vainilla de Reunión (departamento de ultramar de Francia) dio por primera vez frutos. El éxito se produjo gracias a que un esclavo de 12 años de edad llamado Edmond Albius descubrió un método de polinización artificial, el cual es utilizado aún hoy en día (6, 9). La técnica consiste en inclinar o llevar hacia atrás el labelo con ayuda del pulgar. Luego, utilizando un palo pequeño se levanta el rostelo, se junta la antera y el estigma y se presionan (6). En la Figura 1 se esquematiza la polinización artificial de la flor de la vainilla, desarrollada por Edmond Albius. antera estigma masa de polen rostelo utilizando la técnica de Edmond, se levanta el rostelo la antera y el estigma se juntan y se presionan después de la polinización, la masa de polen se adhiere al estigma 1. 2. 3. 4. Figura 1: Polinización manual de la vainilla (6) 4 Luego de este descubrimiento, se inició la propagación de la vainilla por los distintos estados de Reunión y en las islas vecinas del Océano Índico, terminándose de esta manera el monopolio mexicano. Durante el primer cuarto del siglo XX, la producción mundial de vainilla llegaba a 600 toneladas anuales, de las cuales el 25% provenían de América, 40% de Asia y 35% de África. En pocos años después, la producción llegó a 900 toneladas, de las cuales 75% provenían de África, 15% de América y 10% de Asia. Alrededor de 1970, Madagascar produjo el 90% de toda la producción mundial de vainilla natural (12). Hoy en día, el 65 – 70% de la producción anual proviene de las Islas Bourbon (Madagascar, Comores, Reunión, Seychelles), el 25 – 30% de Indonesia y únicamente una parte proviene de México y otros países (10). A lo largo del tiempo se le ha atribuido diversos usos y propiedades a la vainilla. La medicina folklórica, por ejemplo, sugiere propiedades terapéuticas. Se dice que las hojas se utilizan para curar afecciones de la piel o borrar pecas; la raíz se emplea como antiespasmódico y el fruto, como antifebrífugo, afrodisiaco, estimulante y emenagogo (4, 13). A nivel mundial, la importancia del fruto de la vainilla se concentra en la industria alimentaria (para aromatizar y refinar diversos alimentos, especialmente postres y bebidas), así como en la industria farmacéutica y de perfumería (12). 1.1 Especies de vainilla A pesar de la importancia comercial que representa el fruto de la vainilla, las investigaciones taxonómicas de esta planta son escasas e incompletas, lo cual ha llevado a confusiones, sinonimia e incorrecta identificación de las especies. Además de ello, aún falta realizar estudios genéticos que provean de herramientas necesarias para obtener especies resistentes a los patógenos virales y fúngicos, muy comunes en estas especies (1). De las más de cien especies del género Vanilla (aproximadamente 110 especies) se sabe que cada una posee frutos con apariencia, aroma y perfil de sabor único. De todas ellas solo tres son cultivadas por su importancia comercial: Vanilla planifolia Andrews (Vanilla fragans Salisbury Ames), Vanilla tahitensis Moore y Vanilla pompona Schiede (8). 5 Vanilla planifolia Andrews: Los cultivos más importantes se encuentran en las islas Bourbon (Madagascar, Comores, Reunión, Seychelles), Indonesia (Bali), México. Se cultiva también en India, Tonga, Papúa Nueva Guinea y Uganda (14). El extracto de vainas de Vanilla planifolia de las islas Bourbon destaca por sus notas suaves, mantecosas-cremosas, mientras que las notas fenólicas o florales son muy débiles. Por otro lado, el extracto de vainilla procedente de Bali, presenta fuerte notas fenólicas-ahumadas de ciruela pero débiles notas mantecosas y cremosas. El extracto de vainas de vainilla procedente de México posee unas cualidades sensoriales únicas ya que representa el perfil de sabor más completo de entre todos los extractos de vainas de vainilla (10). Vanilla tahitensis Moore: Se producen en las islas de Tahití, Moorea y Papúa Nueva Guinea. Según el botánico mexicano Miguel Soto, la Vanilla tahitensis probablemente es un híbrido de las especies Vanilla planifolia y Vanilla odorata (6). Los frutos de la Vanilla tahitensis son más pequeños y redondeados que los de la Vanilla planifolia (14) y presentan un menor número de semillas; poseen una capa externa muy dura, por lo que no se rajan incluso después de la madurez (6). El extracto es relativamente dulce y mantecoso y destaca por su nota floral y frutal (ciruela y cereza) (14). Tiene gran aceptación en el mercado francés e italiano, principalmente para aromatizar helados. La producción anual de vainas curadas de Vanilla tahitensis es muy pequeña, entre 7 y 8 toneladas, por lo que es muy valorada (6). Vanilla pompona Schiede: Se cultiva casi exclusivamente en Guadalupe y Martinica, ambos territorios de ultramar de la República Francesa. El fruto presenta un olor muy peculiar que puede describirse como una mezcla entre azúcar fermentado y fruta dulce (14). Su principal campo de aplicación son los perfumes y los productos farmacéuticos (10). Existe muy poca información acerca de las vainillas en el Perú. Algunas fuentes (15, 16, 17) reportan que en el Perú existen 6 especies de Vanilla: Vanilla hamata Klotzsch, Vanilla mexicana Miller, Vanilla planifolia Andrews o Vanilla fragans, Vanilla pompona Schiede, Vanilla ruiziana Klotzsch y Vanilla weberbaueriana Kraenzlin (15, 16). De estas, algunas poseen vainas con aroma, por lo que son potencialmente útiles para repostería y bebidas (17). La Vanilla hamaca Klotzsch crece en el departamento de Huánuco. En cuanto a la Vanilla mexicana Miller, no se conoce exactamente su distribución pero se sabe que 6 crece en tierras bajas y pantanosas del Perú, entre 500 y 1 000 m de altitud. La Vanilla planifolia Andrews crece en tierras bajas tropicales, entre 0 y 1470 m de altitud o en bosques inundables del Perú (Maynas, Loreto). La Vanilla pompona Schiede crece en tierras bajas tropicales, entre 15 -1150 m de altitud y en el Perú se encuentra ampliamente distribuida en los departamentos de Amazonas, Loreto, Cajamarca, San Martín, Ucayali y Madre de Dios. La Vanilla ruiziana Klotzsch crece entre los 300 y 350 m de altitud y se encuentra distribuido en los departamentos de Huánuco y Amazonas. La Vanilla weberbaueriana Kraenzlin crece entre los 240 y 500 m de altura y se encuentra distribuido en el departamento de Amazonas (Río Cenepa, Yamayakat) y en Junín (15). En la Figura 2 se detalla la distribución en el Perú de cada una de las especies de vainilla mencionadas. Además de estas especies, los estudios del Programa Botánico de los Andes a la Amazonía (AABP) del Botanical Research Institute of Texas (BRIT), llevado a cabo por John Janovec y su equipo en los humedales del departamento de Madre de Dios, han reportado cuatro especies de Vanilla adicionales (1, 18): Vanilla bicolor Lindl., Vanilla guianensis Split., Vanilla ribeiroi Hoehne y Vanilla sp 4, esta última, una nueva especie aún no asignada. En esta zona, la Vanilla pompona Schiede subsp. grandiflora (Lindl.) Soto-Arenas (Figura 3) abunda. Como parte del estudio se han realizado experimentos de polinización natural (interacción con abejas) y artificial, así como determinación de los factores que afectan la calidad del fruto (19). El departamento de Madre de Dios se encuentra ubicado al sur este del Perú. Posee una extensión de 85 182 km2, una altitud mínima de 183 msnm (Puerto Maldonado) y una máxima de 500 msnm (Boca Manu) (20). En este departamento predomina el clima tropical y húmedo con precipitaciones durante el verano. La temperatura promedio anual del departamento es de 26.5 ºC, y una máxima de 38.5 ºC. Se distinguen dos estaciones, una seca entre mayo y octubre y otra lluviosa entre noviembre y abril. En ciertas épocas del año, el departamento de Madre de Dios es azotado súbitamente por masas de aire frío (denominadas friajes) que provienen del sur del continente. Esto hace que la temperatura de la zona descienda en ciertas épocas del año hasta 9 ºC (21). En el departamento de Madre de Dios, las vainillas crecen casi exclusivamente en humedales, comúnmente llamados “aguajales” por la presencia de la palmera aguaje (Mauritia flexuosa) (1). Esta palmera acoge a la vainilla, es decir que constituye su soporte y a la vez le brinda protección frente al sol y al viento. Es importante que el 7 árbol de soporte tenga raíces profundas para que no extraiga los nutrientes de las capas superiores del terreno, que es donde anidan las raíces superficiales de la vainilla (10). Figura 2: Distribución de las especies de Vanilla en el Perú: Vanilla hamata, Vanilla pompona, Vanilla planifolia (Loreto: Maynas), Vanilla ruiziana y Vanilla weberbaueriana (Amazonas: Río Cenepa, Yamayakat). No se han encontrado datos de la ubicación exacta de Vanilla mexicana. 8 1.2 El fruto de la vainilla: descripción y composición química La importancia comercial de la vainilla radica en el fruto, el cual constituye una de las más caras especias a nivel mundial. El fruto maduro de la vainilla, dependiendo de la especie, es una vaina que puede medir entre 10 y 25 cm de longitud (5, 10) y entre 10 y 15 mm de diámetro (5), carece de aroma, generalmente contiene una pulpa oleosa y numerosas semillas pequeñas. A pesar del gran número de semillas que posee una vaina, la mayor parte de estas no germinan luego de ser sembradas porque, al igual que muchas orquídeas, requieren de una simbiosis específica con un tipo de hongo (6). Este tipo de relación se denomina micorriza y es beneficiosa tanto para el desarrollo de la vainilla como para la del hongo. Las vainas de la vainilla son de color verde brillante cuando están inmaduras y a medida que maduran se tornan amarillas. Generalmente se recolectan cuando están de color verde amarillento (pero no rajadas o abiertas) (5), aunque en algunos lugares se cosecha cuando están aún de color verde (6). Luego de pasar por un complicado proceso de “curado” (descrito en el capítulo 2), las vainas adquieren un color castaño oscuro, se tornan flexibles, su superficie externa se vuelve rugosa y desprenden un agradable aroma. Figura 3: Vanilla pompona Schiede subsp. grandiflora (Lindl.) Soto-Arenas (1) 9 Los componentes del fruto de la vainilla, responsables del olor y sabor, constituyen una mezcla extremadamente compleja (6). Se han identificado más de 180 compuestos químicos, volátiles y no volátiles en las vainas. Entre ellos se encuentran carbonilos aromáticos (7 compuestos), alcoholes aromáticos (6 tipos), ácidos aromáticos (6 tipos), ésteres aromáticos (23 diferentes), éteres fenólicos y fenoles (18 diferentes), alcoholes alifáticos (13 diferentes), carbonilos alifáticos (15 diferentes), ácidos alifáticos (15 diferentes), ésteres y lactonas alifáticas (27 diferentes), hidrocarburos aromáticos (9 diferentes), terpenoides (19 diferentes), hidrocarburos alifáticos (14 diferentes) y heterocíclicos (12 diferentes) (16). Además, las vainas contienen proteína, azúcares, celulosa, resina, taninos y minerales (6). De los grupos de componentes mencionados, más de un tercio corresponden únicamente a volátiles aromáticos. Entre ellos destacan la vainillina (A, Figura 4), el p- hidroxibenzaldehído (B, Figura 4), el ácido p-hidroxibenzoico (C, Figura 4), el ácido vainíllico (D, Figura 4), el alcohol p-hidroxibencílico (E, Figura 4), el y el alcohol 4- hidroxi-3-metoxibencílico (F, Figura 4). La vainillina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído) es el componente mayoritario y el principal responsable del sabor y aroma de las vainas de vainilla. CHO OCH3 OH CHO OH COOH OH COOH OCH3 OH CH2OH OH CH2OH OH OCH3 (A) vainillina (B) p-hidroxibenzaldehído (C) ácido p-hidroxibenzoico (D) ácido vainíllico (E) alcohol p-hidroxibencílico (F) alcohol 4-hidroxi-3metoxibencílico Figura 4: Algunos componentes del extracto de vainilla 10 De todos los componentes de la vainilla, el alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico y el alcohol p-hidroxibencílico muestran actividad antioxidante muy elevada, mientras que la vainillina, el ácido vainíllico y el p-hidroxibenzaldehído, actividad media o relativamente baja (22). Otros beneficios atribuidos a la vainillina son sus propiedades antimutagénicas, antioxidantes y antifúngicas (23). La actividad antifúngica que presenta es atribuida al grupo aldehído que posee y ha sido ampliamente estudiada por Fitzgerald y su equipo de investigación (23). En el año 1988, el Gobierno Francés publicó el documento DGCCRF N.S. 5387 en el que se especificaba el rango de las razones estándar entre los componentes mayoritarios del extracto de vaina de vainilla. Este documento ha sido adaptado por la International Organization of the Flavor Industry (IOFI) y se utiliza a nivel mundial como una guía para comprobar la autenticidad de los extractos de vainilla (Vanilla planifolia específicamente). Los rangos de las razones en masa entre componentes se indican en la Tabla 1. Esta tabla fue construida en base a resultados obtenidos luego de analizar vainas curadas en laboratorio, vainas maduras e inmaduras mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) (24). Tabla 1: Rangos actualizados de las razones en masa entre componentes aromáticos del fruto de la vainilla, donde pHB = p-hidroxibenzaldehído y ácido pHB = ácido p-hidroxibenzoico. Documento DGCCRF N.S. 2003-61 (24) Razón entre componentes de sabor y aroma Rango de las razones en masa entre los componentes R1 = vainillina / pHB 10 – 20 R2 = ácido vainíllico / pHB 0.53 – 1.5 R3 = ácido pHB / pHB 0.15 – 0.35 R4 = vainillina / ácido vainíllico 12 – 29 R5 = vainillina / ácido pHB 40 – 110 Existen otros métodos para analizar y determinar la autenticidad de un extracto de vainilla natural comercial. Este tipo de análisis resulta necesario pues existen en el mercado extractos adulterados (por adición de vainillina sintética o etil vainillina, 11 principalmente). De todos los métodos desarrollados, el análisis isotópico resulta ser el más efectivo. Esta técnica se basa en el hecho de que la distribución de los isótopos a lo largo de la molécula depende del origen del precursor o del tipo de proceso al que fue sometida la molécula precursora (25). En la bibliografía se han reportado rangos de la relación 13C/12C realizados mediante espectroscopía 13C NMR o espectrometría de masas de isótopos estables (IRMS), con lo cual es posible determinar si la vainillina proviene de síntesis a partir de guayacol, ácido ferúlico, lignina, o de biotransformación de ácido ferúlico, entre otros (25). Otros estudios indican que no es suficiente con analizar la vainillina debido a que actualmente se comercializa vainillina sintética enriquecida con 13C. Para solucionar este problema, existen diversas propuestas, entre las que se encuentra la determinación de razón de 13C/12C de los otros componentes aromáticos presentes en las vainas o la obtención de las relaciones entre deuterio e hidrógeno (D/H) por resonancia magnética nuclear (SNIF-NMR) (26). 1.3 Biosíntesis de compuestos del fruto de la vainilla La mayoría de los compuestos fenólicos de bajo peso molecular se presentan en las células vivas en forma combinada, generalmente como O-glucósidos (aglicona – monosacárido, disacárido, o polisacárido) (27). En las plantas, los glucósidos cumplen funciones diversas tales como: almacenamiento de sustancias, aumento de solubilidad de las agliconas en agua (facilita el transporte de agliconas), protección contra los rayos UV-B, movimiento de las hojas en algunas plantas (cierre o apertura de las hojas) y como precursores de los aromas, principalmente de las flores (28). En el caso del fruto de la vainilla, los compuestos responsables del sabor y aroma del fruto se encuentran como glucósidos (aglicona – glucosa) y son liberados solo después de la hidrólisis por acción de enzimas β-D-glucosidasas. Negishi y Ozawa (29) propusieron una ruta biosintética basada en diversas fuentes bibliográficas. En ella intervienen principalmente glucósidos de 3 ácidos hidroxicinámicos, 3 ácidos hidroxibenzoicos, 3 hidroxibenzaldehídos y 3 alcoholes hidroxibencílicos, Figura 5. 12 CH2 CH NH2 COOH CH CH COOH CH CH COOH OH CH CH COOH OH OH CH CH COOH OH OCH3 CH CH COOH OGlc OCH3 CH CH COOH OGlc OH CH CH COOH OGlc CHO OGlc CHO OGlc OH CHO OGlc OCH3 CH2OH OGlc CH2OH OGlc OH CH2OH OGlc OCH3 COOH OGlc COOH OGlc OH COOH OGlc OCH3 CH2O CH2O C O C C C HO R HO H O CHCH2CH3 CH3 CHCH3 CH3 glucósido del ácido p-hidroxibenzoico glucósido del alcohol p-hidroxibencílico glucósido del ácido 3,4-dihidroxibenzoico glucósido del alcohol 3,4-dihidroxibencílico glucósido del ácido vainíllico glucósido del p-hidroxibenzaldehído glucósido del alcohol vainíllico glucósido de 3,4- dihidroxibenzaldehído (proaldehído) glucovanillina fenilalanina ácido cinámico ácido p-cumárico glucósido del ácido p-cumárico glucósido del ácido cafeico ácido cafeico glucósido del ácido ferúlico ácido ferúlico glucósido A: R = glucósido B: R = GlcO GlcO PHBS citocromo P450 monooxigenasa o-metil transferasa VAD Figura 5: Ruta biosintética de los componentes de la vainilla (29, 30) 13 La ruta biosintética se inicia con la deaminación de L-fenilalanina para formar ácido p- cumárico (30). El ácido p-cumárico (compuesto C6-C3) se convierte mediante un acortamiento de cadena, catalizada por la enzima p-hidroxibenzaldehído sintasa (PHBS), a p-hidroxibenzaldehído (compuesto C6-C1); y éste, a su vez, a alcohol p- hidroxibencílico (30). El siguiente paso consiste en una hidroxilación del alcohol p- hidroxibencílico para formar alcohol 3,4-dihidroxibencílico. Este paso es el limitante de la velocidad y está catalizado por la enzima citocromo P450 monooxigenasa (30). A partir del alcohol 3,4-dihidroxibencílico se obtiene 3,4-dihidroxibenzaldehído (conocido también como proaldehído). La siguiente etapa consiste en una metilación del proaldehído para formar la vainillina, catalizada por la enzima o-metil transferasa. En cultivos celulares realizados, se ha observado que parte de la vainillina producida se reduce a alcohol vaníllico. Esta etapa está catalizada por la enzima alcohol vainíllico dehidrogenasa (VAD) (30). Se ha podido separar e identificar por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), los 12 glucósidos así como sus respectivas agliconas (29). Al analizar mediante este método un extracto natural de vainilla, obtenido del fruto maduro de Vanilla planifolia, se ha identificado gran cantidad de glucovainillina y glucósido de p- hidroxibenzaldehído, así como de vainillina y p-hidroxibenzaldehído, corroborando en parte, la ruta biosintética propuesta (29, 30). Estos estudios han permitido el desarrollo de cultivos tisulares comercialmente viables, que presenta una producción de vainillina en un alto rendimiento junto con los otros componentes aromáticos de interés (B – F, Figura 4, principalmente). Con los cultivos tisulares se desea también mejorar la calidad y producción del extracto de vainilla, además de encontrar solución a algunos problemas relacionados con el crecimiento de esta planta (30). Por ejemplo, los resultados obtenidos por Havkin-Frenkel y Podstolski permitieron identificar al ácido málico (entre 0.01 y 5% peso), 3,4- dihidroxibenzaldehído (entre 0.1 y 5 mM), ácido cítrico (0.01 a 5% peso), ácido pirúvico (0.01 a 5% peso), ácido oxaloacético (0.01 a 5% peso), ácido succínico (0.01 a 5% peso), lisozima glicosilada (1 a 100 µg/mL) o una combinación de ellos, como compuestos inductores, que incrementan considerablemente la producción de vainillina en estos cultivos (30). Adicionalmente, se ha demostrado que la manipulación genética, aumento o disminución de ciertas enzimas involucradas en la biosíntesis de la vainillina, permite optimizar la producción de ésta y otros componentes aromáticos (B – F, Figura 4) (30). 14 1.4 Maneras de sustituir a la vainilla natural Según los cálculos realizados por el Centro de Comercio International (CCI) basados en la información proporcionada por United Nations Commodity Trade Statistics Database (UN Comtrade) y publicados en el Perú por la Comisión de Promoción del Perú para la Exportación y el Turismo (PROMPERU), durante el año 2006 las importaciones de vainilla natural fueron de 4 972 toneladas aproximadamente, de las cuales, 1 554 toneladas corresponden a los Estados Unidos, 789 toneladas a Francia, 527 toneladas a Holanda, 422 toneladas a Alemania, 248 toneladas a Canadá, y el resto, a otros países del mundo (Anexo 1). Actualmente, el principal productor de vainilla natural es Madagascar, que en el año 2006 exportó alrededor de 1 679 toneladas de vainilla, seguido de Indonesia, que exportó 499 toneladas. México por su parte exportó solo 32 toneladas (Anexo 2). Por otro lado, la cantidad de vainillina (vainillina sintética principalmente) requerida en todo el mundo durante el 2006 fue de 12 439 toneladas (Anexo 3). China y los Estados Unidos son los principales exportadores de vainillina. En el 2006 China exportó alrededor de 6 945 toneladas, mientras que Estados Unidos, 1 237 toneladas (Anexo 4). A partir de estos datos queda claro que la cantidad de vainilla natural no es suficiente y que gran parte de la demanda de vainilla está siendo cubierta por una esencia de vainilla sintética, de muy bajo precio, pero que consiste únicamente en vainillina. Ésta se produce a nivel industrial a partir de coniferina (glucósido del alcohol coniferílico) (i, Figura 6), eugenol (ii, Figura 6), ácido ferúlico (iii, Figura 6), lignina (iv, Figura 6) y guayacol (v, Figura 6), (25, 31). Debido al creciente interés de los últimos años por consumir productos naturales y utilizar procesos naturales de extracción y de mayor eficacia, se están estudiando procedimientos alternativos para obtener “vainillina de origen natural”. El término “natural”, según la Legislación de Alimentos de la Unión Europea (EU Flavor Directive 88/388/EEC) y de los Estados Unidos, se puede extender a saborizantes o esencias que derivan de otras fuentes naturales (distintas de las vainas de vainilla), ya sea animal o vegetal, pero que han sido transformados por métodos biosintéticos (o bioconversión) (32). Esto significa que en lugar de utilizar vainas de vainilla curadas (vi, Figura 6), es posible emplear moléculas precursoras disponibles ampliamente en la naturaleza y convertirlas luego en las moléculas de sabor y aroma deseadas, mediante 15 determinadas enzimas, microorganismos o cultivos celulares. Por lo tanto, esta regulación representa una alternativa para suplir la gran demanda de vainilla natural. Se ha desarrollado, por ejemplo una serie de métodos utilizando precursores ampliamente disponibles, como los estilbenos fenólicos (de la corteza de la pícea); (a), en Figura 7, el eugenol (principal constituyente del clavo de olor); (b), en Figura 7, el ácido ferúlico (abundante en las plantas); (c), en Figura 7, entre otros procesos (d – g), en Figura 7 (32). H3CO O HO O HO OH OH COOH CH2OH OH OCH3 CHO OCH3 OH OCH3 OH (iv) Lignina (de la industria del papel) OCH3 OH (i) Coniferina (ii) Eugenol (iii) Ácido ferúlico (v) Guayacol Vainillina síntesis síntesis síntesis (vi) Vainas de vainilla síntesis síntesis extracción Figura 6: Algunas de las principales fuentes de vainillina (adaptación de 25) 16 CHO OCH3 OH R OCH3 OH OCH3 OH COOH OCH3 OH NH2 HO O OH H OH OH H H HO H OCH3 CHO HO OH OH H OH OH H H HO H COOH OCH3 OH OCH3 OH COOH Vainillina Isoeugenol, R = -CH3 Isorhapotin, R = (corteza de pícea) O glucosa OH Aspergillus niger Pycnoporus cinnabarinus -glucosidasa, proveniente de bacterias o de la planta Glucovainillina (vainas maduras de Vanilla sp.) Glucosa Ácido vainíllico Ácido ferúlico cultivos celulares, raíces aéreas, hongos, levaduras, bacterias bacterias, hongosEugenol L-fenilalanina bacterias, hongos estilbenos dioxigenasas de Pseudomonas paucimobilis TMY 1009 (a) (b) (c) (d) (f) (g) (e) Figura 7: Producción biotecnológica de la vainillina. Además de la fuente tradicional (vainas de vainilla), la vainillina se puede obtener por biotransformación de algunos otros precursores (32). Sin embargo, estas nuevas propuestas no son aún económicamente factibles (presentan bajo rendimiento) y en muchos casos no se obtiene un producto con todos los componentes secundarios de aroma y sabor que posee la vainilla natural (32). En el caso de cultivos celulares, la mayor dificultad radica en encontrar células o tejidos 17 que puedan desarrollarse de manera adecuada en cultivos y por tiempo prolongado. Además, la extracción de estos componentes a partir de los distintos cultivos celulares, resulta ser un proceso poco eficiente (33). A pesar del esfuerzo por obtener vainillina mediante biotransformación, la Food and Drug Administration (FDA) señala que solo es posible rotular como “vainilla natural” aquellos extractos o vainillina que provienen del fruto de la vainilla. Los provenientes de biotransformación necesariamente deben rotularse como “sabor natural” pero dentro de la categoría de saborizantes distintos del extracto natural de vainilla (30). En cuanto al precio de la vainilla que se ofrece hoy en día en el mercado, éste varía considerablemente, dependiendo de su origen. La vainilla natural o extracto de vainilla obtenido a partir de las vainas puede llegar a costar entre 1 500 y 3 000 dólares americanos por kilogramo. La vainillina obtenida por biotransformación se vende aproximadamente a 1 000 dólares americanos por kilogramo. Por su parte, un kilogramo de vainillina sintetizada de manera química se vende a 15 dólares americanos (30). A pesar del menor precio, la desventaja de emplear tanto vainillina sintética como vainillina proveniente de otras fuentes naturales procesadas por métodos biosintéticos, es que el producto carece de los demás componentes responsables del sabor y aroma que posee la vainilla natural. 18 2 DETERMINACIÓN DEL PERFIL AROMÁTICO DEL FRUTO DE LA VAINILLA 2.1 Proceso de curado de la vainilla La cosecha de los frutos de vainilla se realiza cuando las vainas han perdido su forma angular y sus bordes se tornaron redondeados. En este estado, las vainas no están aún abiertas, son de color verde brillante y sus extremos, de color amarillo. Se recolectan en canastos e inmediatamente se realiza una clasificación de los frutos, separando las vainas de primera clase de las de calidad inferior. Las vainas de calidad inferior son aquellas que miden menos de 12 cm de longitud o que fueron cosechadas tardíamente y que se encuentran abiertas. Las vainas de calidad inferior se procesan por separado (34). A nivel comercial, el extracto natural de vainilla no se prepara a partir del fruto recién cosechado, sino con vainas que han sido sometidas a un tratamiento previo llamado “proceso de curado”. Mediante este proceso los glucósidos de vainillina y otros componentes son liberados o hidrolizados por acción de la enzima endo-β-D- glucosidasa. De esta manera se logra que el fruto adquiera el aroma característico, al liberar a las agliconas respectivas (A – F, Figura 4). El proceso de curado difiere según el país e incluso entre las diversas áreas de producción. Esta diferencia puede tener una influencia muy importante en la variación de la calidad y del perfil aromático de las vainas que se comercializan (34). El curado sigue siendo una técnica tradicional y artesanal que consiste básicamente en cuatro etapas: marchitamiento, sudado, secado y acondicionamiento (6, 34, 35, 36). El curado se inicia sumergiendo las vainas frescas en baño de agua caliente (60 – 75 ºC) por 1, 2 ó 3 minutos (etapa de marchitamiento). Con esta temperatura se logra detener el proceso vegetativo natural del fruto (o evitar la dehiscencia) y perturbar la estructura celular, pero no inactivar las enzimas responsables de la hidrólisis de glucósidos. El proceso de curado mexicano inicialmente no contaba con esta etapa, pero se sabe que actualmente sí la incluyen en su proceso (6). Luego de este paso, se escurren las vainas, se envuelven en frazadas y se colocan en unas cajas cerradas herméticamente por 24 horas, para que se enfríen muy lentamente. A continuación se lleva a cabo la etapa de soleado y transpiración (sudado). Esta consiste en exponer las vainas al sol durante la hora más caliente del día (generalmente cubiertas con frazadas) por un período de 2 a 3 horas y por las noches guardarlas en cajas 19 herméticamente cerradas para que continúe el proceso de transpiración. En el proceso de sudado se eleva la temperatura para promover las reacciones enzimáticas, provocar un secado inicial rápido y evitar fermentaciones dañinas (34). Gran parte del aroma se desarrolla en esta etapa debido a la actividad de las enzimas propias del fruto (36). Este procedimiento se repite todos los días por un período de 2 a 3 semanas. Al cabo de este tiempo las vainas se tornan de un color café. Durante esta etapa, se deben inspeccionar cuidadosamente las vainas y en caso de que se observe crecimiento de hongos, se realiza uno de los siguientes procedimientos, según la gravedad del problema (34): Leve: Se limpia las vainas afectadas con una tela empapada de alcohol. Moderado: Las vainas afectadas se limpian con alcohol y además se hierven por 1 hora. Severo: Si el daño no es superficial sino que es interno, se corta y desecha la parte dañada y la otra parte se limpia con alcohol y se hierve por 1 hora. Siguiendo con el proceso de curado, las vainas se alisan y estiran una por una. A continuación se lleva a cabo el proceso de secado, el cual se realiza a temperatura ambiente y en lugares bien ventilados y libres de humedad. El secado dura aproximadamente 1 mes y culmina cuando las vainas reduzcan su peso inicial a un tercio (contenido final de humedad de 18 – 30% humedad). El fin del proceso de secado se caracteriza por el cambio de color café, que presenta luego del proceso de sudado, a negro (34) así como por la flexibilidad, suavidad y aroma de las vainas (35). El proceso de curado finaliza con la etapa de acondicionamiento, el cual puede extenderse algunos meses (entre tres y cuatro meses aproximadamente). Durante este periodo se hace más notable el desarrollo de las características sensoriales del fruto de la vainilla, es decir, su sabor y agradable aroma (36). En el proceso de acondicionamiento, las vainas son atadas en grupos de 50 unidades, se envuelven en papel encerado y se almacenan en recipientes cerrados. Son conservados en ambientes ventilados, a temperaturas entre 35 y 40 ºC. Cada semana las vainas son inspeccionadas (34). 20 Una vez concluido el proceso de acondicionamiento, se procede a la clasificación de las vainas según su color, calidad y tamaño. Se atan en grupos de 50 vainas utilizando ligas de hule o pabilo, se envuelven en papel cera, se colocan en bolsas de polietileno y estas a su vez se colocan en cajas de cartón selladas. Finalmente, las vainas están listas para ser exportadas o comercializadas (34). Al finalizar el extenso proceso de curado, se obtienen unas vainas delgadas, oscuras y flexibles, con una superficie ligeramente oleosa y con la inconfundible fragancia de la vainilla (10). Dado que el proceso de curado puede durar incluso hasta nueve meses, se han realizado esfuerzos para acelerar este proceso mediante el uso de hornos. Esta práctica se realiza especialmente en algunas zonas de Indonesia. Sin embargo, las vainas que se obtienen por este método, a pesar de tener suficiente cantidad de vainillina, presentan algunas diferencias físicas (aspecto y humedad, principalmente) lo cual hace que sean consideradas como vainas de menor calidad (6). En el proceso de curado están involucrados procesos térmicos, reacciones enzimáticas y actividad microbiana. Dentro de las reacciones enzimáticas, no solo participa la enzima β-D glucosidasa sino también otras, como las polifenol oxidasas y peroxidasas, responsables del cambio de color de verde a marrón, así como de la producción del aroma (36). Aparte del proceso enzimático, se sabe que existe una contribución microbiana en la obtención del sabor y aroma de la vainilla. Esta contribución ha sido muchas veces sugerida pero muy poco investigada. Se sabe que en la degradación microbiana de la celulosa y hemicelulosa están involucrados β- glucosidasas; que la degradación de la lignina por microorganismos (hongo blanco, actinomicetas y otras bacterias) pueden producir compuestos aromáticos; y que la actividad microbiana en las paredes celulares produce ácido ferúlico, el cual por acción de bacterias y hongos puede transformarse en componentes de aroma y sabor (36). Roling y su equipo de investigación (36) realizaron estudios de la comunidad microbiana en vainas de vainilla a lo largo de todo el proceso de curado. Ellos detectaron la presencia de gran cantidad de bacilos termofílicos y termotolerantes (B. smithi, B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilis y B. firmus) en vainas curadas y demostraron también que estos eran escasos en vainas frescas. Los resultados mostraron que el mayor cambio en la comunidad microbiana se produce durante las dos primeras etapas de curado (36). 21 Sin embargo, a pesar del extenso proceso, se ha comprobado que en el caso de las vainas curadas de manera artesanal, la transformación enzimática no es eficiente (37). Se ha demostrado que recurriendo a enzimas exo-β-D-glucosidasas, el contenido de la vainillina y de los otros componentes aromáticos aumenta (37, 38). El proceso enzimático, en el cual se produce la hidrólisis de los glucósidos o liberación de las agliconas respectivas, se describe en la sección 2.2.2 para el caso de vainas frescas. Ranadive y su equipo de investigación (38) encontraron que este tratamiento puede incrementar en 24% el contenido de vainillina. Esto se demostró en el caso de vainillas curadas de Tahití, Tonga, Jamaica y Madagascar. Otras investigaciones reportan un incremento de más de 14% en el contenido de vainillina al tratar vainillas curadas con exo pectinasa y exo-β-gucosidasa (37). 2.2 Extracción de los componentes del fruto de la vainilla A continuación se va a detallar los procesos involucrados en la extracción de los distintos componentes aromáticos (A – F, Figura 4) en vainas curadas y frescas de vainilla. 2.2.1 Extracción a partir de vainas curadas Una vez concluido el proceso de curado artesanal, el extracto de vainilla se obtiene mediante un simple tratamiento alcohólico de las vainas. A nivel comercial, se cortan o trituran las vainas curadas y se maceran en una solución de etanol – agua por unos días, semanas e incluso meses, hasta obtener un líquido marrón con fuerte olor y sabor a vainilla. Se puede acelerar este proceso calentado la mezcla en reactores y a altas temperaturas (39). Según la Food and Drug Administration (FDA), un extracto de vainilla debe contener 100 g de vainas curadas (cuya humedad sea menor de 25%) en 1 L de alcohol acuoso de concentración no menor a 35%. Otra manera de realizar la extracción de los componentes aromáticos es mediante solventes (hidrocarburos) o utilizando fluidos supercríticos (40, 41, 42), generalmente CO2. Mediante este último, se obtiene un extracto de vainilla denominado “vainilla absoluta”, cuyo precio está alrededor de 5 000 dólares americanos por kilogramo (6). 22 Se trata de una técnica selectiva puesto que el extracto contiene únicamente los componentes responsables del sabor y aroma (42). Este extracto se utiliza únicamente en las fragancias de más alta calidad. A nivel de laboratorio, el extracto se obtiene mediante extracción Soxhlet de las vainas curadas, con una solución de etanol acuoso 47.5% v/v durante 24 horas (37, 43). En estos extractos alcohólicos, la vainillina es el componente más abundante. Su porcentaje es por lo general de 2% en peso del material seco, pero en ocasiones puede llegar a 3 – 4% en peso. Se sabe que las vainas que han sido curadas de manera inadecuada presentan una ligera disminución en el contenido de vainillina (6), y que el contenido de los otros componentes aromáticos presentes en el extracto (alcohol p-hidroxibencílico, alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, ácido p- hidroxibenzoico, p-hidroxibenzaldehído y ácido vainíllico, en la Figura 4) también varía según el tipo de tratamiento al que fueron sometidas las vainas. 2.2.2 Extracción a partir de vainas frescas Como se mencionó anteriormente, la vainillina y otros componentes aromáticos no se encuentran como tales en las vainas frescas, sino como β-D-glucósidos. La hidrólisis de la glucovainillina y los otros glucósidos se inicia de manera natural, ya sea en una etapa tardía de maduración o en una etapa temprana del proceso de curado (44). Se sabe que en vainas maduras (antes de la dehiscencia) tanto la glucovainillina como la enzima β-D-glucosidasa coexisten pero sin que se produzca la hidrólisis (44). Este fenómeno no ha sido aún totalmente esclarecido, pero existen dos hipótesis al respecto. La primera es que la enzima y el sustrato no se encuentran en el mismo tejido o, si lo están, se encuentran en diferentes compartimientos (44, 45). La segunda posibilidad es que la enzima y el sustrato se encuentran en contacto pero existen otros factores como la presencia de inhibidores (inhibidores β-D-glucosidasa, por ejemplo) que impiden la hidrólisis (44). Dado que la hidrólisis de glucósidos es un paso muy importante en la obtención del sabor y aroma de la vaina y debido a que no existe información completa de la morfología, anatomía e histología de la vaina, Odoux y su equipo de investigación (44) realizaron los estudios correspondientes. Mediante microscopía electrónica analizaron 23 las distintas zonas de una vaina fresca, las cuales se presentan en la Figura 8. En cada una de ellas se midió la concentración del sustrato (glucovainillina) y la actividad de la enzima β-D-glucosidasa. Se observó que la glucovainillina no está presente en las zonas 1 y 2 pero sí en las zonas 3, 4 y 5 (Figura 8A, i). En otro experimento en el que se congeló la vaina, se encontró que la mayor concentración de glucovainillina se encuentra alrededor de la zona 7, la cual presenta color blanquecino debido a que la glucovainillina es insoluble a bajas temperaturas (Figura 8B). La actividad de la β-D- glucosidasa se midió utilizando dos sustratos distintos, p-nitrofenil-β-D-glucósido (Figura 8ii) y glucovainillina (Figura 8iii) y se observó que en ambos casos la distribución de la enzima es similar a lo obtenido en la Figura 8i al cuantificar la glucovainillina. La mayor actividad se encuentra en las zonas 3 y 4. Se estudió también el comportamiento de las enzimas en presencia (barras blancas) y ausencia (barras negras) de una determinada concentración de glucona-δ-lactona, un inhibidor competitivo β-D-glucosidasa. área blanquecina y lechosa 1 2 3 4 5 7 6 Zona Zona Zona A ct iv id a d (n ka t g ) -1 A ct iv id ad ( nk a t g ) -1 G lu co va in ill in a (m M ) A B i ii iii Figura 8: Los gráficos de la izquierda muestran la distribución de la vainilla en zonas. (A) Vaina a temperatura ambiente y (B) vaina congelada. Los gráficos de la derecha detallan la concentración de glucovainillina (8i) y la actividad de la enzima en las diferentes zonas utilizando como sustrato p-nitrofenil-β-D-glucósido (8ii) y glucovainillina (8iii) (44). 24 Los resultados de la investigación de Odoux y su equipo (44) revelaron que el sustrato y la enzima se encuentran en los mismos tejidos, pero esto no significa que ambos se encuentran en el mismo compartimiento subcelular. Probablemente la enzima β-D- glucosidasa se encuentra en el compartimiento citoplásmico y/o periplásmico y la glucovainillina, en el vacuolar (44). La hidrólisis de los glucósidos presentes en las vainas frescas ocurre en una etapa tardía de maduración o durante el proceso de curado (44), debido a que en estas etapas se producen alteraciones en la estructura celular. Dado que la hidrólisis de glucósidos no se produce de manera espontánea en vainas frescas y teniendo en cuenta que el proceso de curado es muy extenso, diversos estudios muestran que es posible realizar una hidrólisis enzimática de vainas frescas en el laboratorio. Se realiza generalmente añadiendo una o más enzimas que muestran actividad glucosidasa (enzimas exo-β-D-glucosidasa) (46). Estas enzimas mayormente consisten en una mezcla de enzimas que poseen actividad celulasa, hemicelulasa, xilanasa, pectinasa y/o β-glucosidasa, en particular β-D-glucosidasa. Comercialmente existe una serie de enzimas adecuadas para llevar a cabo la hidrólisis, tales como Viscozima (Novo), Celuclast (Novo), Depol 40L (Biocatalysts Limited, Wales UK), Cristalzime Concord (Valley Research, Inc., South Bend, Ind.), entre otros (39). Con el objetivo de evaluar el perfil aromático del fruto de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios y demostrar que posee suficiente cantidad de vainillina, se decidió evaluar vainas frescas. Con ello, se evitó realizar el extenso proceso de curado tradicional y en su lugar las vainas se sometieron a hidrólisis enzimática, utilizando una mezcla de enzimas comerciales (Viscozima y Celuclast). El éxito de un tratamiento enzimático depende de las condiciones a las que se trabajen. Las condiciones óptimas incluyen, mínimo grado de alcohol en la solución acuosa utilizada (no mayor de 10 % v/v), pH entre 3 y 7, agitación constante y temperatura no mayor de 82 ºC. El tratamiento o incubación se realiza por lo general por un tiempo no mayor de 10 horas (39) y se requiere por lo menos una enzima que presente entre 10 y 1 000 unidades β-glucosidasa por gramo de vaina de vainilla (46). Otro factor muy importante a considerar en una extracción enzimática es la actividad específica β-D-glucosidasa de cada una de las enzimas con las que se va a trabajar. 25 La medición de la actividad β-D-glucosidasa de las enzimas se puede realizar de diversas maneras. Uno de los métodos más comunes es el colorimétrico, en el que por lo general se detecta la cantidad de glucosa liberada luego de la hidrólisis de un determinado glucósido, por acción de las enzimas β-D-glucosidasas. Un método muy utilizado por diversos grupos de investigadores para determinar glucosa es el del ácido 3, 5-dinitrosalicílico, desarrollado por Miller (47). La glucosa es un azúcar reductor, que en medio alcalino es capaz de reducir el ácido 3,5- dinitrosalicílico (amarillo, λmáx = 360 nm) a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (rojo-marrón, λabs = 550 nm). Sin embargo, Cañizares-Macías y su equipo (48) indican que la reducción no ocurre a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico sino a ácido 3,5-diaminosalicílico (rojo-marrón, λmáx = 480 nm). La reacción se esquematiza en la Figura 9, en donde el sustrato a hidrolizar por los complejos enzimáticos es la celobiosa. HO O HO OH O OH O HO OH OH OH HO O HO OH OH OH NO2 COOH OH O2N HO OH COOHHO OH OH NH2 COOH OH O2N NH2 COOH OH H2N gluocosidasas glucosa ácido 3,5-dinitrosalicílico máx = 360 nm ácido glucónico ácido 3-amino-5-nitrosalicílico abs = 550 nm ácido 3,5-diaminosalicílio máx = 480 nm ó celobiosa Figura 9: Método del ácido 3,5-dinitrosalicílico para cuantificar glucosa liberada luego de la hidrólisis de la celobiosa por acción de las glucosidasas. Algunas fuentes indican que el ácido 3,5-dinitrosalicílico se reduce a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (47) mientras que otras aseguran que se forma el ácido 3,5-diaminosalicílico (48). 2 1 26 Utilizando esta metodología, la actividad de estas enzimas se define como mg de glucosa liberada por mL de enzima por minuto (mg glucosa / mL enzima x minuto). 2.3 Cuantificación de los componentes del fruto de la vainilla mediante HPLC Según la AOAC International, el método oficial para analizar un extracto de vainilla y/o un saborizante artificial de vainilla es mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Se trata del método Nº 990.25 e incluye el análisis de ácido p- hidroxibenzoico, ácido vainíllico, vainillina, p-hidroxibenzaldehído y etil vainillina (49). Por ello, el análisis de los extractos de vainas de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios, preparado siguiendo los pasos ilustrados en la Figura 10 (extracción Soxhlet, extracción etanólica y extracción en medio acuoso), se realizó mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Mediante los seis estándares (vainillina, p-hidroxibenzaldehído, ácido p-hidroxibenzoico, ácido vainíllico, alcohol p-hidroxibencílico y alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, A – F, en la Figura 4) se prepararon las curvas correspondientes que permitieron cuantificar cada componente. El presente estudio consistió, entonces, en evaluar el perfil aromático de vainas de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios. Para ello, fue necesario determinar las condiciones adecuadas de separación por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) de cada uno de los seis componentes (A – F, Figura 4), así como cuantificar su contenido mediante las curvas estándar preparadas. Este perfil aromático se comparó con el de la vainilla de Madagascar (Vanilla planifolia Andrews), especie de gran importancia a nivel comercial. 27 Vainas secas y molidas Incubación a 45ºC por 1 hora MarcoSolución acuosa EtOH filtración Extracción etanólica (EtOH 95%) Extracción Soxhlet (EtOH 47.5%) Análisis HPLC Curvas estándar con patrones Condiciones de separación de agliconas (A – F, Figura 4) Extracción en medio acuoso H2O + enzimas + incubación (45 ºC por 8 horas) Figura 10: Esquema de trabajo 28 3 PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Equipos y Materiales Los análisis por HPLC fueron realizados en un sistema de HPLC LaChrom D-7000 Merck-Hitachi, con software HSM 7000 (versión 4.0, Merck-Hitachi) y columna Lichrospher C18 125x4 mm. Los componentes con los que cuenta el equipo son: degasificador de solvente en línea Merck L-7612, interfase D-7000 Merck-Hitachi, bomba cuaternaria LaChrom L-7100 Merck-Hitachi, horno para columna L-7350, inyector Rheodyne 9125 y detector de arreglo de diodos UV-VIS L-7450A. Los espectros UV-VIS se realizaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 2, con software UV WinLab – versión 2.80.03 Perkin Elmer 1994–1999, Perkin Elmer Corp. Los ensayos para determinar la actividad de las enzimas (Viscozima y Celuclast) se realizaron en un Molecular Devices Versamax Tunable Microplate Reader, cuyo rango de longitud de onda es de 340 a 850 nm. El software empleado fue SoftMax® Pro. El sistema de liofilización LABCONCO, Freeze Dry System / Freezone 4.5, se utilizó para el secado del material vegetal. La pulverización del material seco se realizó con un molino eléctrico IKA® MF 10.1. El calentamiento y agitación constante durante la extracción enzimática se realizó en una incubadora Heidolph Instruments, INKUBATOR 1000 / UNIMAX 1010. Los reactivos Viscozima (código V2010, lote 085K1587), Celuclast (código C2730, lote 074K1156), ácido 3,5-dinitrosalicílico, D-(+)-glucosa, celobiosa, alcohol p- hidroxibencílico, alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, ácido p-hidroxibenzoico, p- hidroxibenzaldehído, ácido vainíllico y vainillina fueron adquiridos de Sigma – Aldrich, mientras que dihidrógenofosfato de potasio e hidróxido de sodio en lentejas de Merck; etanol 99.9% de J.T. Baker y fosfato dibásico de sodio anhidro de Mallinckrodt AR. El agua Milli-Q fue proporcionado por el Instituto de Corrosión y Protección de la Pontificia Universidad Católica del Perú. 29 El estudio químico que se presenta en este trabajo se centra en la Vanilla pompona Schiede subsp. grandiflora (Lindl.) Soto-Arenas, especie abundante en los humedales de Madre de Dios. Los frutos fueron obtenidos mediante polinización asistida realizada por Ethan Householder, participante del equipo de John Janovec – BRIT (Botanical Research Institue of Texas). Estas fueron recolectadas específicamente de un humedal que se encuentra a 2 km de la estación biológica CICRA (Centro de Investigación y Capacitación Río de los Amigos), en Madre de Dios. Se cuenta con cuatro tipos de vainas de vainilla: 1. Vainas de Vanilla pompona maduras, recolectadas aproximadamente en el sétimo mes de crecimiento, cuando presentaban color amarillo, pero aún sin que se hayan abierto. 2. Vainas de Vanilla pompona inmaduras, recolectadas entre el tercer y cuarto mes de crecimiento, de color verde (antes de su maduración). 3. Vainas de Vanilla pompona de prueba: Un lote de vainas maduras enviadas a Lima fueron sometidas a condiciones inadecuadas durante el viaje. Estos frutos fueron almacenados en bolsas de plástico cerradas. Con estas vainas se realizaron las pruebas preliminares para determinar las condiciones óptimas de tiempo y temperatura de incubación enzimática, proporción adecuada de enzimas, entre otros. 4. Vainas de Vanilla planifolia curadas, obtenidas de un mercado de Lima. Las vainas maduras e inmaduras de Vanilla pompona fueron recolectadas en el año 2006, pero en épocas distintas. Una vez recibidas, todas las vainas se colocaron en nitrógeno líquido por 10 minutos y se almacenaron en el congelador a –25 ºC. Las vainas congeladas fueron liofilizadas y una vez secas, molidas finamente (ø = 2 mm). Las vainas de Vanilla planifolia curadas fueron adquiridas en el Mercado de Surquillo. Fueron compradas a diferentes vendedores y en diferentes épocas. Unas fueron adquiridas en marzo del 2006 y otras, en setiembre del 2007. El precio actual de una vaina de Vanilla planifolia curada en el mercado peruano es de 20 soles. Estas vainas fueron tratadas de manera similar a las vainas de Vanilla pompona: congelamiento con nitrógeno líquido, liofilizado y molienda. 30 3.2 Metodología 3.2.1 Medición de actividad β-D-glucosidasa de las enzimas Se determinó la actividad de las enzimas comerciales Viscozima y Celuclast, las cuales se utilizaron durante la hidrólisis enzimática. La Viscozima (densidad: 1.2 g/mL), obtenida del Aspergillus sp., es una mezcla multienzimática compuesta por arabinasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas y β-glucanasas, con rango de pH para actividad óptima entre 3.3 y 5.5, a una temperatura entre 50 y 60 ºC. El Celuclast (densidad: 1.2 g/mL), obtenido del Trichoderma reseii, cataliza la hidrólisis de celobiosa, celulosa y otros carbohidratos, con rango de pH de actividad óptima entre 4.5 y 4.8 a temperatura entre 48 y 60 ºC. La actividad β-D-glucosidasa de ambas enzimas (Viscozima y Celuclast) se determinó utilizando el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (47, 48), esquematizado en la Figura 9. Se empleó celobiosa como sustrato y la incubación se llevó a cabo en buffer fosfato pH = 5.00. Este buffer se preparó disolviendo KH2PO4 (4.5 g) y Na2HPO4 (0.04 g) en agua Milli-Q (1 L). Se ajustó el pH añadiendo Na2HPO4. Para determinar el contenido de glucosa liberada por acción de cada una de las enzimas (Viscozima y Celuclast) en un determinado tiempo es necesario contar con una curva estándar de glucosa que permita cuantificar la glucosa liberada mediante el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (47, 48). La curva estándar se preparó con disoluciones de glucosa de 16, 10, 5, 2, 1 y 0.5 mM en buffer fosfato pH = 5.00. Para la validación de la curva estándar se preparó 3 soluciones de glucosa de 4.32, 8.42 y 12.28 mM en buffer fosfato pH = 5.00. Se preparó una solución 8.7 mM de ácido 3,5-dinitrosalicílico disolviendo el ácido 3,5- dinitrosalicílico (0.2 g) en una solución de NaOH 0.8 M (100 mL). Se mezcló la solución de glucosa (2 mL) con la solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico (2 mL). Se colocó en el termostato a 80 ºC por 30 minutos. Al cabo de este tiempo, se dejó enfriar en baño de hielo por 2 minutos. Se tomó 200 µL de la solución, se colocó en una microplaca y se leyó la absorbancia a 550 nm en el Versamax. Se procedió de manera secuencial con cada solución de glucosa. El blanco (solución buffer) se trabajó de la misma manera. Cada concentración de glucosa se realizó por triplicado y la absorbancia reportada en cada caso es el promedio de ocho lecturas. 31 Para medir la actividad de las enzimas, se preparó una solución 4 mM de celobiosa (0.07 g de celobiosa en 50 mL de solución buffer fosfato pH = 5.00). Se colocó 24 mL de esta solución en una fiola de 25 mL, se añadió 150 µL de Viscozima ó 300 µL de Celuclast, según la enzima a estudiar, y se enrasó con buffer fosfato. Se colocó 2 mL de la solución en cuatro viales etiquetados como 0, 5, 20 y 30 minutos respectivamente. Se taparon los viales, se cubrieron con papel aluminio y se colocaron en la incubadora a 45 ºC, por el tiempo indicado en las etiquetas. Luego de la incubación, se añadió la solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico (2 mL) para oxidar la glucosa liberada y se colocó en el termostato a 80 ºC por 30 minutos. Se dejó enfriar en baño de hielo por 2 minutos, se colocó en una microplaca (200 µL) y se midió la absorbancia de cada una de las muestras a 550 nm, usando el Versamax. De manera paralela se preparó un blanco, en el cual se realizó todo el procedimiento anterior excepto la adición de alguna de las enzimas. El proceso se realizó por duplicado y cada medida de absorción fue realizada ocho veces. 3.2.2 Determinación de humedad Para determinar la humedad de las vainas, primero se pesó el material vegetal fresco. Luego, se congeló con nitrógeno líquido por 30 minutos y se liofilizó por 3 días. Al cabo de este tiempo el material vegetal seco se pesó. El contenido de humedad se reportó como la diferencia entre el peso inicial y final por gramo de vaina de vainilla fresca. Este proceso se realizó por cuadruplicado. 3.2.3 Extracción de los componentes de vainilla (A – F, Figura 4) Los componentes de la vainilla fueron extraídos de las vainas siguiendo los tres procesos de extracción mencionados en la Figura 10. Los métodos utilizados para cada tipo de vaina se indican en la Tabla 2. 32 Tabla 2: Procedimientos realizados para extraer los componentes de interés de la vainilla, con los diferentes tipos de vainas Vaina En medio acuoso Etanólica Soxhlet Vanilla pompona madura   Vanilla pompona inmadura  Vanilla pompona de prueba    Vanilla planifolia  Extracción en medio acuoso: Se pesó 1 g del material vegetal seco y finamente molido. Se añadió agua Milli-Q (10 mL), Viscozima (150 µL) y Celuclast (300 µL). Se dejó bajo agitación constante a 45 ºC por 8 horas. Luego de este tiempo se agregó etanol 99.9% (10 mL) y se dejó bajo agitación constante a 45 ºC por 1 hora más. La suspensión se filtró al vacío. El sólido se lavó dos veces con agua Milli-Q (1.5 mL aproximadamente). La solución se llevó a una fiola de 25 mL y se enrasó con agua Milli-Q. De esta última solución se tomó 7.5 mL, se colocó en una fiola de 10 mL y se enrasó con agua Milli-Q (porcentaje final de etanol, 30%). Se tomó 20 μL de esta solución final y se analizó por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) tanto a 230 como a 254 nm. De manera paralela se realizó un blanco, con el objetivo de evaluar el perfil aromático de la vainilla antes de la hidrólisis enzimática. Se realizó todo el procedimiento descrito anteriormente, excepto la adición de las enzimas. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y cada una de las muestras se analizó dos veces por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Extracción etanólica: Se pesó 1 g del material vegetal seco y finamente molido. Se añadió etanol 95% (5 mL) y se dejó reflujar por 1 hora (50). Se rotaevaporó todo el etanol y se siguió el procedimiento descrito para el caso de una extracción en medio acuoso. Extracción Soxhlet: Se pesó y se envolvió en papel filtro de filtración rápida 2 g del material vegetal seco y finamente molido. Esta extracción se realizó siguiendo estrictamente el procedimiento propuesto por Voisine y su equipo de investigadores (43). En este caso, la extracción Soxhlet se realizó con una solución de etanol al 47.5% v/v (200 mL), durante 24 horas. Se rotaevaporó a menos de 100 mL de solución (remoción total del EtOH), se llevó a una fiola de 100 mL y se enrasó. Se 33 tomó 10 mL de la solución, se añadió Viscozima (150 µL) y Celuclast (300 µL) y se siguió el mismo procedimiento descrito en el caso de la extracción en medio acuoso. De manera similar se trabajó un blanco. Teniendo como referencia el protocolo de Ruiz-Terán y colaboradores (37), se realizó además la extracción Soxhlet de 2 g de vainas de Vanilla pompona secas y finamente molidas con etanol 47.5% v/v (50 mL) pero durante 7 horas. Se enrasó a 50 mL, se tomó 25 mL de esa solución y se rotaevaporó todo el etanol. Esta última solución (10 mL) se sometió a extracción en medio acuoso para llevar a cabo la hidrólisis enzimática. De manera similar se trabajó un blanco. 3.2.4 Cuantificación de los componentes del extracto mediante HPLC Los componentes de la vainilla se separaron por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). En la bibliografía utilizada (29, 37, 43) se describen diversos sistemas para la fase móvil. Después de realizar varios ensayos se optó por trabajar con un sistema de gradiente ácido fosfórico 0.001 M – metanol, de varias etapas, resultados que se describen en la siguiente sección. Para cuantificar los seis componentes de interés de la vainilla se elaboraron curvas estándar de alcohol p-hidroxibencílico, alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, ácido p- hidroxibenzoico, p-hidroxibenzaldehído, ácido vainíllico y vainillina. Para ello, se disolvió alcohol p-hidroxibencílico (0.06 g), alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico (0.09 g), ácido p-hidroxibenzoico (0.04 g), p-hidroxibenzaldehído (0.11 g), ácido vainíllico (0.07 g) y vainillina (0.23 g) en etanol 99.9% (100 mL). A partir de esta solución se realizan 7 diluciones a 100 mL con alícuotas de: 30, 22.5, 15, 7.5, 3, 0.3 y 0.03 mL. En todas ellas la concentración de EtOH fue del 30% v/v. Las soluciones se analizaron por HPLC a 230 y a 254 nm. En todos los casos, el volumen inyectado fue de 20 µL. Se graficó área (obtenido de los cromatogramas) versus concentración de cada componente en mM. Cada curva se realizó por triplicado. Para la validación de las curvas estándar se preparó una solución en EtOH 99.9% (100 mL) que contenía alcohol p-hidroxibencílico (0.02 g), alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico (0.03 g), ácido p-hidroxibenzoico (0.02 g), p-hidroxibenzaldehído (0.01 g), ácido vainíllico (0.01 g) y vainillina (0.09 g). De la solución anterior se tomó una alícuota de 3 mL, se llevó a una fiola de 10 mL y se enrasó con agua Milli-Q. Se analizó por HPLC. 34 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Actividad β-D-glucosidasa de las enzimas La longitud de onda a la que se monitorea la reacción entre el ácido 3,5- dinitrosalicílico y un azúcar reductor (glucosa o celobiosa) es 550 nm, debido a que a esta longitud de onda tanto el azúcar reductor como el ácido 3,5-dinitrosalicílico no presentan absorbancia. En la Figura 11 se presenta el espectro UV-VIS del ácido 3,5- dinitrosalicílico. Figura 11: Espectro UV-VIS del ácido 3,5-dinitrosalicílico La curva estándar de glucosa obtenida siguiendo la metodología descrita en 3.2 se presenta en la Figura 12. Esta ha sido obtenida del resultado de tres distintos 35 experimentos. La cuantificación de algunas soluciones problema, con distintas concentraciones de glucosa (Tabla 3), permitieron validar dicha curva. y = 0.2630x + 0.0298 R2 = 0.9977 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 [glucosa], mM A b so rb an ci a Figura 12: Curva estándar de glucosa (promedio de tres diferentes experimentos) Tabla 3: Validación de la curva estándar de glucosa Muestra problema [teórico], mM [experimental], mM * % error Muestra 1 2.160 2.270 ± 0.080 5.1 Muestra 2 4.210 4.400 ± 0.140 4.5 Muestra 3 6.140 6.260 ± 0.080 2.0 (*) Los resultados son promedio de dos experimentos independientes En cuanto a la actividad de las enzimas, no ha sido posible determinar la actividad de Viscozima y Celuclast utilizando celobiosa como sustrato, a pesar de que Ruiz-Terán y su equipo (37) reportan, con este mismo sustrato, que Viscozima puede liberar 5.8 ± 1 mg glucosa / mL producto x minuto y Celuclast, 5.0 ± 0.4 mg glucosa / mL producto x minuto. En nuestro caso hemos observado que las enzimas hidrolizan la celobiosa tan rápido que no es posible observar un cambio gradual del contenido de glucosa a lo 36 largo del tiempo. Se probó variando las concentraciones de sustrato y enzima e incluso trabajando a temperaturas muy bajas, pero no se logró observar la hidrólisis gradual. Sin embargo, se puede afirmar que ambas enzimas cumplen su función correctamente ya que se observó la absorbancia esperada para 4 mM de glucosa (absorbancia alrededor de 1.1, según la curva estándar de glucosa presentada en la Figura 12) a partir de una solución 2 mM de celobiosa. En las Figuras 13 y 14 se puede verificar lo mencionado. En ambos casos se observa que no hay variación considerable de absorbancia a lo largo del tiempo, ya que desde un inicio se observa la absorbancia máxima esperada (1.1 aproximadamente). 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tiempo (min) A b so rb an ci a Figura 13: Actividad de Viscozima empleando celobiosa como sustrato. La línea azul representa el blanco, es decir, la absorbancia debido a la reacción entre celobiosa (azúcar reductor) y ácido 3,5-dinitrosalicílico, en la que se produce la reducción de este último a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (47) o ácido 3,5-diaminosalicílico (48). La línea roja indica la absorbancia debido a la reacción entre el ácido 3,5-dinitrosalicílico y la glucosa liberada (azúcar reductor) por acción de Viscozima a lo largo del tiempo. 37 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tiempo (min) A b so rb an ci a Figura 14: Actividad de Celuclast empleando celobiosa como sustrato. La línea azul representa el blanco, es decir, la absorbancia debido a la reacción entre celobiosa (azúcar reductor) y ácido 3,5-dinitrosalicílico, en la que se produce la reducción de este último a ácido 3-amino-5- nitrosalicílico (47) o ácido 3,5-diaminosalicílico (48). La línea roja indica la absorbancia debido a la reacción entre el ácido 3,5-dinitrosalicílico y la glucosa liberada (azúcar reductor) por acción de Celuclast a lo largo del tiempo. El hecho de que Ruiz-Terán y su equipo de investigación (37) pudieran observar la actividad de ambas enzimas utilizando celobiosa como sustrato podría deberse a que sus complejos enzimáticos posiblemente presentaban menor actividad que el utilizado por nosotros. El proveedor de ambas enzimas (Sigma – Aldrich) indica que la actividad de Viscozima es 122.4 unidades por mL, utilizando carboximetilcelulosa como sustrato y que la actividad de Celuclast es 957.6 unidades por mL, utilizando beta glucan como sustrato. Dado que no se contaba con ninguno de estos sutratos y que Ranadive (38) emplea enzimas comerciales con actividad β-glucosidasa para curar vainas frescas y maduras en el laboratorio en una determinada proporción (0.5 mg de enzima por gramo de vaina de vainilla seca), se procedió a trabajar con las enzimas mencionadas sin importar su actividad específica, pero esperando obtener experimentalmente la cantidad óptima a utilizar. 38 4.2 Humedad de los frutos de Vanilla pompona y de Vanilla planifolia En cuanto a la humedad de los frutos de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios, se determinó que el porcentaje de humedad es de 85%. Este valor se determinó utilizando vainas inmaduras de Vanilla pompona y es el promedio de cuatro distintos experimentos en los que se obtuvo 85.7, 85.4, 85.1 y 85.4 % de humedad respectivamente. El porcentaje de humedad de las vainas de Vanilla planifolia curadas adquiridas en el mercado es del 10%. Nuestros resultados son corroborados por los obtenidos por Graves y su equipo de investigación (51), quienes afirman que el contenido de humedad de las vainas de vainilla es por lo general alrededor de 85%. En el caso de vainas curadas, algunas fuentes, señalan que el porcentaje de humedad oscila entre 25 y 30%, por lo que se puede afirmar que nuestras vainas, obtenidas comercialmente, se encuentran mucho más secas. 4.3 Análisis y cuantificación por HPLC El sistema de gradiente (Tabla 4) utilizado para finalmente lograr una adecuada separación de los componentes (A – F, Figura 4) requirió varias etapas. Tabla 4: Sistema de gradiente ácido fosfórico 0.001 M – metanol Tiempo (min) H3PO4 (0.001 M) Metanol 0 90 10 5 90 10 15 60 40 20 60 40 30 90 10 40 90 10 39 Este sistema permitió separar al alcohol p-hidroxibencílico (tR = 5.3 minutos) del alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico (tR = 8.5 minutos), mientras que el ácido p- hidroxibenzoico eluyó a 10.9 minutos, el p-hidroxibenzaldehído a 12.5 minutos, el ácido vainíllico a 13.4 minutos y la vainillina a 14.8 minutos. El alcohol p-hidroxibencílico y el alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico se evalúan a 230 nm, mientras que el ácido p-hidroxibenzoico, el p-hidroxibenzaldehído, el ácido vainíllico y la vainillina, a 254 nm. A pesar de que todos los estudios previos indican que la longitud de onda adecuada es 254 nm, se decidió trabajar con dos lambdas distintos pues al analizar los espectros UV-VIS de cada uno de los componentes, los cuales se presentan en las Figuras 15 – 17, queda claro que los λmáx de absorción del alcohol p-hidroxibencílico y del alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico se encuentran alrededor de 230 nm, presentando muy poca absorbancia a 254 nm, mientras que, el ácido p-hidroxibenzoico, el p-hidroxibenzaldehído, el ácido vainíllico y la vainillina sí presentan una considerable absorbancia a 254 nm. Figura 15: Espectro UV de (A) alcohol p-hidroxibencílico en etanol (0.006 mg/mL) y (B) alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico en etanol (0.006 mg/mL) nm nm (A) (B) 40 Figura 16: Espectro UV de (A) ácido p-hidroxibenzoico en etanol (0.006 mg/mL) y (B) p- hidroxibenzaldehído en etanol (0.006 mg/mL) Figura 17: Espectro UV de (A) ácido vainíllico en etanol (0.006 mg/mL) y (B) vainillina en etanol (0.006 mg/mL) nm nm (A) (B) nm nm (A) (B) 41 Estos resultados son muy importantes, pues resulta ser el primer estudio en donde se reporta el contenido de alcohol p-hidroxibencílico y de alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico. Investigaciones previas indican que la separación inadecuada de estos dos componentes ha sido una limitación para su estudio. Al respecto, Ranadive (38) menciona que se sabe que el alcohol p-hidroxibencílico y el alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico están también presentes en los extractos de Vanilla planifolia y tahitensis analizados por él y su equipo de investigación, pero debido a que no se ha podido lograr una separación adecuada mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), no ha sido posible cuantificarlos. Tanto nuestro gradiente como el monitoreo a dos longitudes de onda (230 y 254 nm) simultáneamente han permitido detectar y cuantificar exitosamente los seis componentes aromáticos del extracto de vainilla. En la Figura 18 se muestra el perfil de una mezcla de alcohol p-hidroxibencílico, alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, p-hidroxibenzoico, p-hidroxibenzaldehído, ácido vainíllico y vainillina (componentes puros) a 254 nm. En la Figura 19 se muestra la misma mezcla de compuestos pero a 230 nm. Figura 18: Cromatograma del ácido p-hidroxibenzoico (tR = 10.89 min), p-hidroxibenzaldehído (tR = 12.47 min), ácido vainíllico (tR = 13.21 min) y vainillina (tR = 14.71 min), monitoreado a λ = 254 nm 1 . 2 1 1 . 6 0 4 . 0 9 4 . 6 1 5 . 2 9 8 . 5 3 9 . 6 1 1 0 . 8 9 1 2 . 4 7 1 3 . 2 1 1 4 . 7 1 1 6 . 8 5 1 7 . 8 1 1 8 . 6 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 42 Figura 19: Cromatograma de alcohol p-hidroxibencílico (tR = 5.29 min) y alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico (tR = 8.52 min), monitoreado a λ = 230 nm Las curvas estándar obtenidas para cada uno de los componentes (alcohol p- hidroxibencílico, alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, p-hidroxibenzoico, p- hidroxibenzaldehído, ácido vainíllico y vainillina) se presentan en las Figuras 20 – 25. Todas las curvas son resultado de 3 distintos experimentos. Para validar cada una de las curvas se preparó una solución problema con determinada concentración de cada componente. En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos. La concentración teórica se calculó a partir del peso de cada componente añadido en la solución problema y la concentración experimental se calculó a partir de las ecuaciones de recta respectivas. 0 . 8 5 1 . 0 7 1 . 2 3 1 . 6 0 3 . 4 7 3 . 9 9 4 . 2 3 5 . 2 9 8 . 5 2 1 0 . 3 3 1 0 . 8 9 1 2 . 4 9 1 3 . 2 1 1 4 . 8 1 1 7 . 8 0 1 8 . 5 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 43 Figura 20: Curva estándar del alcohol p-hidroxibencílico medida a λ = 230 nm (promedio de tres diferentes experimentos) Figura 21: Curva estándar del alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico medida a λ = 230 nm (promedio de tres diferentes experimentos) y = 3492176.0895x R2 = 0.9999 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 Concentración, mM Á re a 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 0.000 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 C oncent ración, mM y = 3732502.3933x R2 = 0.9998 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 Concentración, mM Á re a 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 0.000 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.021 C o ncent ració n, mM 44 Figura 22: Curva estándar del ácido p-hidroxibenzoico medida a λ = 254 nm (promedio de tres diferentes experimentos) Figura 23: Curva estándar del p-hidroxibenzaldehído medida a λ = 254 nm (promedio de tres diferentes experimentos) y = 8402945.1719x R2 = 0.9998 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Concentración, mM Á re a 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 C oncent ración, mM y = 2490957.8426x R2 = 0.9999 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 Concentración, mM Á re a 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 C oncent ración, mM 45 Figura 24: Curva estándar del ácido vainíllico medida a λ = 254 nm (promedio de tres diferentes experimentos) Figura 25: Curva estándar de la vainillina medida a λ = 254 nm (promedio de tres diferentes experimentos) y = 1265077.3040x R2 = 0.9999 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 Concentración, mM Á re a 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 0.000 0.008 0.016 0.024 0.032 0.040 0.048 C o ncent ració n, mM y = 5186066.7257x R2 = 0.9999 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 Concentración, mM Á re a 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 C o ncent ració n, mM 46 Tabla 5: Concentraciones teóricas y experimentales de los componentes de la vainilla (A – F, Figura 4) para la validación de las curvas estándar Compuesto [teórico], mM [experimental], mM * % error Alcohol p-hidroxibencílico 0.396 0.388 ± 0.008 2.2 Alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico 0.479 0.467 ± 0.004 2.5 Ácido p-hidroxibenzoico 0.428 0.419 ± 0.005 2.2 p-hidroxibenzaldehído 0.339 0.339 ± 0.001 0.2 Ácido vainíllico 0.221 0.215 ± 0.001 2.8 Vainillina 1.801 1.790 ± 0.011 0.6 (*) Los resultados son promedio de tres experimentos independientes analizados por HPLC por duplicado 4.4 Hidrólisis enzimática y determinación del perfil aromático La proporción adecuada de cada enzima (150 μL de Viscozima y 300 μL de Celuclast en 10 mL ó 0.18 g de Viscozima y 0.36 g de Celuclast por gramo de vaina seca) fue determinada luego de distintos experimentos utilizando vainas de prueba en los que se trabajó con 1.5 mL de Viscozima (B, Tabla 6), 1.5 mL de Celuclast (C, Tabla 6), 150 μL de Viscozima (E, Tabla 6), 600 μL de Viscozima (G, Tabla 6), 150 μL de Viscozima con 150 μL de Celuclast (H, Tabla 6), 300 μL de Viscozima con 300 μL de Celuclast (I, Tabla 6) y 150 μL de Viscozima con 300 μL de Celuclast (J, Tabla 6). A partir de estos resultados se pudo verificar que la cantidad óptima y mínima necesaria para hidrolizar todos los glucósidos es 150 μL de Viscozima y 300 μL de Celuclast (J, Tabla 6) pues a estas concentraciones de cada enzima, el porcentaje de componentes es el máximo esperado. Se realizaron, además, algunas pruebas para determinar el tiempo adecuado para hidrolizar todos los glucósidos. Se observó que utilizando 150 μL de Viscozima, tanto a 8 horas como a 16 horas (F, Tabla 6) de incubación se obtienen resultados similares. Sin embargo, a 4 horas de incubación (D, Tabla 6), la cantidad de alcohol p- hidroxibencílico, ácido p-hidroxibenzoico, p-hidroxibenzaldehído y vainillina es menor. Por ello, se define como tiempo mínimo = 8 horas de incubación. 47 El resultado de todos los experimentos realizados (Tabla 6) se reporta en porcentaje en peso (gramo por 100 gramos de vaina seca). Todas las muestras se realizaron por duplicado (experimentos independientes) y cada una de ellas fue analizada mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) por duplicado. Los cromatogramas obtenidos de cada experimento, tanto a 230 nm como a 254 nm, se presentan en los Anexos 5 – 24. Tabla 6: Resultados de experimentos realizados para determinar la cantidad óptima de enzimas (Viscozima y Celuclast) a utilizar Alcohol p-hidroxibencílico (% peso) Alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico (% peso) Ácido p-hidroxibenzoico (% peso) p-hidroxibenzaldehído (% peso) Ácido vainíllico (% peso) Vainillina (% peso) A Blanco (sin enzimas) 0.13 0.18 0.01 0.02 0.06 1.26 B 1.5 mL de Viscozima, 8 horas 0.81 0.20 0.02 0.03 0.08 1.44 C 1.5 mL de Celuclast, 8 horas 0.83 0.22 0.02 0.03 0.08 1.38 D 150 μL de Viscozima, 4 horas 0.24 0.19 0.01 0.02 0.07 1.32 E 150 μL de Viscozima, 8 horas 0.43 0.18 0.02 0.03 0.07 1.37 F 150 μL de Viscozima, 16 horas 0.42 0.19 0.02 0.03 0.07 1.40 G 600 μL de Viscozima, 8 horas 0.62 0.20 0.02 0.03 0.07 1.41 H 150 μL de Viscozima + 150 μL de Celuclast, 8 horas 0.61 0.19 0.02 0.03 0.07 1.41 I 300 μL de Viscozima + 300 μL de Celuclast, 8 horas 0.76 0.19 0.02 0.03 0.07 1.44 J 150 μL de Viscozima + 300 μL de Celuclast, 8 horas 0.71 0.20 0.02 0.03 0.07 1.45 Descripción Una vez validados los métodos de hidrólisis enzimática y de separación y cuantificación, se procedió a analizar el perfil aromático de los diferentes extractos de vainas maduras e inmaduras de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios y de las vainas curadas de Vanilla planifolia. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 7. El contenido de cada uno de los componentes del fruto se reporta en porcentaje en peso (gramo por 100 gramos de material vegetal seco). Todas las muestras se realizaron por duplicado (experimentos independientes) y cada una de 48 ellas fue analizada mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) por duplicado. Los cromatogramas obtenidos de los blancos y de las muestras, tanto a 230 nm como a 254 nm, se presentan en los Anexos 5 – 6 y 23 – 52. La cantidad de enzimas utilizada en cada experimento fue 150 μL de Viscozima y 300 μL de Celuclast. Tabla 7: Contenido de los componentes de la vainilla en distintos tipos de vainas Blanco Muestra Blanco Muestra Blanco Muestra Blanco Muestra Blanco Muestra Blanco Muestra I Vanilla pompona inmadura, extracción acuosa 2.32 3.81 0.00 0.03 0.01 0.03 0.02 0.02 0.01 0.02 0.16 0.28 II Vanilla pompona de prueba, extracción acuosa 0.13 0.71 0.18 0.20 0.01 0.02 0.02 0.03 0.06 0.07 1.26 1.45 III Vanilla pompona de prueba, extracción etanólica 0.11 0.52 0.18 0.19 0.01 0.02 0.02 0.03 0.06 0.08 1.33 1.46 IV Vanilla pompona de prueba, Soxhlet 7 horas 0.09 0.75 0.14 0.15 0.01 0.01 0.03 0.03 0.07 0.07 1.50 1.57 V Vanilla pompona madura, extracción acuosa 0.61 0.71 0.13 0.14 0.01 0.02 0.04 0.05 0.06 0.07 2.54 2.70 VI Vanilla pompona madura, Soxhlet 24 horas 0.18 0.54 0.00 0.10 0.01 0.02 0.05 0.06 0.06 0.08 2.72 3.28 VII Vanilla planifolia curada, adquirida en marzo del 2006, extracción acuosa 0.06 0.38 0.04 0.11 0.03 0.05 0.09 0.10 0.16 0.23 1.64 1.85 VIII Vanilla planifolia curada, adquirida en setiembre del 2007, extracción acuosa 0.04 0.16 0.01 0.02 0.03 0.03 0.12 0.12 0.11 0.13 1.30 1.46 Descripción p-hidroxibenzaldehído (% peso) Ácido vainíllico (% peso) Vainillina (% peso) Alcohol p-hidroxibencílico (% peso) Alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico (% peso) Ácido p-hidroxibenzoico (% peso) Los resultados de la Tabla 7 indican que las vainas inmaduras (I, Tabla 7) presentan un bajo contenido de todos los componentes, excepto de alcohol p-hidroxibencílico, que se encuentra en muy alta proporción. Esto se debe probablemente a que la vainillina y los otros componentes son biosintetizados a partir del alcohol p- hidroxibencílico. Las vainas que fueron sometidas a condiciones inadecuadas durante el viaje (vainas de prueba) (II, Tabla 7) presentan un menor contenido de vainillina con respecto a las vainas maduras (V, Tabla 7). Esto se debe a que ésta puede haberse disuelto en el 49 agua que las rodeó por varios días, dentro de las bolsas de plástico cerradas en la que llegaron a la Pontificia Universidad Católica del Perú. El perfil aromático de las vainas maduras (V, Tabla 7) es de lo más promisorio pues al compararlo con el perfil aromático de la vainilla comercial (VII y VIII, Tabla 7) se observa mucho mayor contenido de vainillina. El contenido de vainillina de las vainas curadas de Vanilla planifolia es de 1.85 % peso, mientras que el de Vanilla pompona madura, 2.70 % peso. Sin embargo, el contenido de los otros componentes es menor. Esto se debe probablemente a una característica entre especies (Vanilla pompona en nuestro caso y Vanilla planifolia en el caso de las vainas comerciales) aún no precisada por ningún otro trabajo científico. No se observa gran diferencia entre una extracción en solución acuosa (II, Tabla 7) y una extracción etanólica previa a una acuosa (III, Tabla 7). Sin embargo sí se observa gran diferencia entre una extracción en solución acuosa y una extracción Soxhlet previa a una acuosa (II versus IV y V versus VI en Tabla 7). Los resultados muestran que la extracción Soxhlet es más eficiente que la extracción en solución acuosa, debido a que en este caso se puede lograr maximizar la extracción de los glucósidos presentes en las vainas. Mediante extracción Soxhlet se puede obtener alrededor de 8% más de vainillina, observado en el caso de vainas de prueba (IV, Tabla 7) y 20 % más de vainillina, en el caso de vainas maduras (VI, Tabla 7). Esta diferencia puede deberse a que las vainas maduras fueron sometidas a extracción Soxhlet por 24 horas, mientras que las vainas de prueba solo por 7 horas. A partir de estos resultados, se puede afirmar entonces que la extracción Soxhlet por tiempo prolongado maximiza la extracción de los componentes de interés, y que la Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios presenta un alto porcentaje de vainillina (3.28 % peso) con respecto a la Vanilla planifolia curada comercial. En cuanto a las vainas curadas de Vanilla planifolia (VII y VIII, Tabla 7) se observa que hay una ligera diferencia en el contenido de algunos componentes aromáticos, entre las adquiridas en marzo del 2006 y las obtenidas en setiembre del 2007. Al respecto, algunos estudios han demostrado que los componentes se encuentran asociados al grado de madurez del fruto, al origen geográfico (38), así como al proceso de curado al que cada cual ha sido sometido, el cual varía dependiendo del país, territorio o comunidad (6). Dado que se desconoce el origen real de estas vainas curadas de 50 Vanilla planifolia, adquiridas en un mercado de Lima no es posible comentar más al respecto. En la Tabla 8 se presentan las razones entre los componentes de sabor y aroma (R1 – R5) de la Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios y de las vainas de Vanilla planifolia curadas adquiridas en un mercado de Lima, según la International Organization of the Flavor Industry (IOFI). Tabla 8: Relación entre los componentes de aroma y sabor (R1 – R5) de vainas de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios y de vainas de Vanilla planifolia curadas obtenidas comercialmente Relación Vanilla pompona madura Vanilla pompona madura (Soxhlet 24 horas) Vanilla planifolia curada (marzo 2006) Vanilla planifolia curada (setiembre 2007) R1 = vainillina/pHB 59.4 59.6 18.5 11.9 R2 = ácido vainíllico/pHB 1.5 1.4 2.3 1.1 R3 = ácido pHB/pHB 0.4 0.4 0.5 0.2 R4 = vainillina/ácido vainíllico 39.9 42.5 8.2 11.2 R5 = vainillina/ácido pHB 168.9 165.6 35.9 48.6 En el caso de vainas maduras de Vanilla pompona, se observa claramente que R2 y R3 están dentro del rango establecido por la International Organization of the Flavor Industry (IOFI), ver Tabla 1, página 10. Sin embargo, sabemos que estas proporciones no tienen por qué coincidir pues estos valores han sido establecidos para la Vanilla planifolia. Si bien existen estudios similares para la Vanilla tahitesis, para la Vanilla pompona no se ha reportado rangos de este tipo. La mayoría de las razones entre componentes (R1 – R5) de Vanilla planifolia curadas obtenidas comercialmente están dentro del rango esperado por la International Organization of the Flavor Industry (IOFI). En el caso de las vainas curadas de Vanilla planifolia adquiridas en marzo del 2006, se observa que R2, R3 y R4 no están comprendidas dentro de los rangos esperados. Estos resultados indican que probablemente no se trate de Vanilla planifolia. Sin embargo, las vainas curadas comerciales adquiridas en setiembre del 2007 sí encajan dentro de los rangos esperados, corroborándose así, la especie Vanilla planifolia. 51 El trabajo aquí presentado forma parte de los primeros estudios que se están realizando entre la Pontificia Universidad Católica del Perú y el Botanical Research Institute of Texas (BRIT), con el objetivo de encontrar las condiciones óptimas de cosecha, curado y determinación del perfil aromático de la Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios. Los resultados han demostrado que las vainas maduras de Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios contienen un elevado porcentaje de vainillina (VI en Tabla 7), mucho mayor al de las vainas curadas comerciales de Vanilla planifolia. Esto hace que la Vanilla pompona de los humedales de Madre de Dios sea considerada como un producto con gran potencial económico. Los resultados obtenidos del perfil aromático de la Vainilla pompona de los humedales de Madre de Dios justifican continuar realizando los esfuerzos necesarios para identificar el tiempo de cosecha adecuado y establecer las condiciones propicias para llevar a cabo el proceso de curado. 52 5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES - No fue posible determinar la actividad de las enzimas comerciales Viscozima y Celuclast, pues la celobiosa no resultó ser el sustrato apropiado: la hidrólisis fue inmediata. Se recomienda utilizar carboximetilcelulosa para determinar la actividad de Viscozima y beta glucan para determinar la actividad de Celuclast, tal como lo indica Sigma – Aldrich. Sin embargo, la correcta actividad de ambas enzimas ha quedado demostrada tanto mediante los experimentos realizados con la celobiosa, así como por los resultados obtenidos con diferentes proporciones de enzimas (Tabla 6). - Se ha determinado las condiciones cromatográficas adecuadas para la correcta separación de los seis componentes aromáticos de importancia de las vainas de vainilla, a saber, alcohol p-hidrozibencílico, alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico, ácido p-hidroxibenzoico, p-hidroxibenzaldehído, ácido vainíllico y vainillina. Este es el primer estudio de la separación cromatográfica y debida cuantificación del alcohol p-hidroxibencílico y del alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico en extractos de vainilla. - El contenido de vainillina en Vanilla pompona madura luego de una hidrólisis enzimática (extracción en medio acuoso) fue de 2.70% en peso. El contenido en porcentaje en peso de los otros componentes fue el siguiente: alcohol p- hidroxibencílico (0.71%), alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico (0.14%), ácido p- hidroxibenzoico (0.02%), p-hidroxibenzaldehído (0.05%), y ácido vainíllico (0.07%). - El contenido de vainillina en Vanilla pompona de prueba y Vanilla pompona madura luego de la extracción Soxhlet, 7 horas y 24 horas, seguida de hidrólisis enzimática (extracción en medio acuoso) fue de 1.57% y 3.28% en peso, respectivamente. En cuanto a los otros componentes, el contenido hallado fue, alcohol p-hidroxibencílico (0.75% y 0.54%), alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico (0.15 y 0.10%), ácido p-hidroxibenzoico (0.01 y 0.02%), p- hidroxibenzaldehído (0.03% y 0.06%), y ácido vainíllico (0.07 y 0.08%), respectivamente. Se concluye, por lo tanto, que mediante extracción Soxhlet es posible obtener entre 8% (extracción Soxhlet durante 7 horas) y 20% (extracción Soxhlet durante 24 horas) más de vainillina que sin ella. Por ello, el método recomendado para futuros estudios es extraer 2 g de material vegetal 53 seco (finamente molido) mediante Soxhlet por 24 horas y luego tratar el extracto con las enzimas correspondientes (150 μL de Viscozima y 300 μL de Celuclast en 10 mL de solución, por 8 horas a 45 oC), seguido el proceso por una incubación en etanol al 50 %, por 1 hora. - El contenido de vainillina y otros componentes (alcohol 4-hidroxi-3- metoxibencílico, ácido p-hidroxibenzoico, p-hidroxibenzaldehído y ácido vainíllico) en las vainas inmaduras de Vanilla pompona es muy bajo con respecto al contenido observado en vainas maduras de Vanilla pompona. En el caso del alcohol p-hidroxibencílico éste resultó ser mucho mayor. Esto demuestra que el tiempo para que se desarrollen los precursores de aroma y sabor (glucósidos) no ha sido el suficiente. Se recomienda, por tanto, definir adecuadamente el mejor momento de cosecha, el cual tendrá que ser superior a los 4 meses de formado el fruto. - El contenido de vainillina en Vanilla planifolia curada (adquiridas en marzo del 2006 y setiembre del 2007) fue 1.85% y 1.46% peso, respectivamente. En cuanto a los otros componentes: alcohol p-hidroxibencílico (0.38% y 0.16%), alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico (0.11% y 0.02%), ácido p-hidroxibenzoico (0.05% y 0.03%), p-hidroxibenzaldehído (0.10% y 0.12%), y ácido vainíllico (0.23% y 0.13%), respectivamente. Dado que las razones entre los componentes (R1 – R5) para el caso de las vainas de Vanilla planifolia curadas adquiridas en setiembre del 2007 están comprendidas dentro del rango establecido por la International Organization of the Flavor Industry (IOFI), quedó demostrado que este producto sí corresponde a la especie Vanilla planifolia. - Los resultados obtenidos justifican plenamente continuar realizando esfuerzos para identificar el tiempo de cosecha adecuado y para establecer las condiciones propicias de curado de la Vainilla pompona de los humedales de Madre de Dios. 54 6 REFERENCIAS 1. Householder, E. Diversity, natural history of Vanilla in wetlands of Madre de Dios, Peru, Capítulo 1 en Diversity and Natural History of Vanilla of Madre de Dios, Peru, Tesis de Maestría de Texas Christian University, 2007. 2. Royal Botanic Gardens, KEW. Epiphytes: adaptations to an aerial habitat. Disponible en: http://www.kew.org/ksheets/epiphytes.html. Consultada el 5 de diciembre del 2007. 3. 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United States Patent Nº 2,835,591. 60 Anexo 1: Lista de países importadores de vainilla en el año 2006 Lista de los países importadores del producto seleccionado en 2006 Producto: 0905 Vainilla Importadores Total importado en 2006, en miles de US$ Cantidad importada en 2006 Unidad de medida Valor de unidad (US$/unidad) Crecimiento anual en valor entre 2002- 2006, % Crecimiento anual en cantidad entre 2002-2006, % Crecimiento anual en valor entre 2005- 2006, % Participación en las importaciones mundiales, % Incluido en Comtrade en 2006 Estimación Mundo 122,021 4,972 Toneladas 24,542 -28 2 -3 100 Estados Unidos de América 44,387 1,554 Toneladas 28,563 -36 7 -11 36 Francia 25,868 789 Toneladas 32,786 -26 14 24 21 Alemania 14,132 422 Toneladas 33,488 -19 21 3 11 Japón 7,583 118 Toneladas 64,263 -22 7 -9 6 Canadá 5,446 248 Toneladas 21960 1 39 72 4 Países Bajos (Holanda) 3,521 527 Toneladas 6,681 2 15 -25 2 Reino Unido 2,525 171 Toneladas 14,766 -40 5 -33 2 Bélgica 2,402 96 Toneladas 25,021 1 20 22 1 Dinamarca 2,205 34 Toneladas 64,853 -6 -10 -11 1 Suiza y Liechtenstein 2,188 43 Toneladas 50,884 -24 -1 -36 1 Italia 1,529 21 Toneladas 72810 -18 -1 -10 1 Singapur 1,234 114 Toneladas 10,825 -23 12 -42 1 Austria 875 38 Toneladas 23,026 -16 -30 -21 0 Suecia 820 26 Toneladas 31,538 -2 -1 -12 0 España 671 18 Toneladas 37,278 -1 5 20 0 Australia 670 39 Toneladas 17,179 -28 20 -45 0 Madagascar 614 28 Toneladas 21,929 41 527 0 Irlanda 563 73 Toneladas 7,712 -8 7 -32 0 Noruega 475 3 Toneladas 158,333 -8 -4 -10 0 Polonia 403 2 Toneladas 201500 -8 -2 -49 0 Indonesia 275 57 Toneladas 4,825 -46 -52 34 0 México 236 27 Toneladas 8,741 -25 -16 84 0 Malasia 209 46 Toneladas 4,543 -8 -12 43 0 Georgia 179 69 Toneladas 2,594 108 38 348 0 República de Corea 168 3 Toneladas 56000 -22 16 -44 0 Luxemburgo 162 2 Toneladas 81000 -5 -11 7 0 Sudafrica 149 8 Toneladas 18,625 44 44 -1 0 Mauricio 148 5 Toneladas 29600 -35 -17 -23 0 Portugal 146 6 Toneladas 24,333 -15 -16 -66 0 Nueva Zelandia 144 5 Toneladas 28800 -11 10 -48 0 Hong Kong (RAEC) 131 12 Toneladas 10,917 -21 30 52 0 Finlandia 121 2 Toneladas 60500 14 -9 -12 0 Barbados 101 16 Toneladas 6,313 33 36 621 0 Uganda 99 6 Toneladas 16500 118 4850 0 Rumania 84 1 Toneladas 84000 37 58 0 República Dominicana 82 4 Toneladas 20500 94 0 Armenia 76 10 Toneladas 7600 25 -20 -8 0 Brasil 73 1 Toneladas 73000 -49 -32 -47 0 China 67 3 Toneladas 22,333 9 -44 0 Fuente: Cálculos del CCI basados en estadísticas de COMTRADE 61 Anexo 2: Lista de países exportadores de vainilla en el año 2006 Lista de los países exportadores del producto seleccionado en 2006 Producto: 0905 Vainilla Exportadores Total exportado en 2006, en miles de US$ Cantidad exportada en 2006 Unidad de medida Valor de unidad (US$/unidad) Crecimiento anual en valor entre 2002- 2006, % Crecimiento anual en cantidad entre 2002-2006, % Crecimiento anual en valor entre 2005- 2006, % Participación en las exportaciones mundiales, % Incluido en Comtrade en 2006 Estimación Mundo 116,525 4,323 Toneladas 26,955 -28 -72 -4 100 Madagascar 47,373 1,679 Toneladas 28,215 -34 15 3 40 Y Francia 17,740 480 Toneladas 36,958 -12 30 36 15 Y Alemania 10,346 215 Toneladas 48,121 -17 13 -18 8 Y India 6,504 168 Toneladas 38,714 -5 33 171 5 Indonesia 5,892 499 Toneladas 11,808 -31 -84 10 5 Y Uganda 4,808 191 Toneladas 25,173 1 71 -22 4 Y Canadá 4,499 129 Toneladas 34,876 -1 55 96 3 Y Estados Unidos de América 4,056 170 Toneladas 23,859 -25 -2 -48 3 Y Papua Nueva Guinea 3,929 246 Toneladas 15,972 -23 40 -23 3 Comoras 3,796 67 Toneladas 56,657 -35 -9 -43 3 Polinesia Francesa 1,815 9 Toneladas 201,667 -7 -6 -13 1 Y Singapur 1,029 55 Toneladas 18,709 -31 23 -53 0 Y Bélgica 605 44 Toneladas 13750 -12 2 21 0 Y Países Bajos (Holanda) 545 19 Toneladas 28,684 -2 -29 -86 0 Y Austria 477 6 Toneladas 79500 -1 -48 -2 0 Y Reino Unido 315 19 Toneladas 16,579 -65 -29 -48 0 Y México 289 32 Toneladas 9,031 -46 -45 -25 0 Y Polonia 280 2 Toneladas 140000 12 -43 0 Y Dinamarca 252 15 Toneladas 16800 -8 -6 76 0 Y Suecia 245 24 Toneladas 10,208 27 137 -27 0 Y Australia 226 35 Toneladas 6,457 16 20 -54 0 Y Suiza y Liechtenstein 219 2 Toneladas 109500 -7 3 -64 0 Y Japón 194 2 Toneladas 97000 -26 -7 48 0 Y Turquía 177 47 Toneladas 3,766 -25 -28 -36 0 Y Sudafrica 117 14 Toneladas 8,357 66 61 -44 0 Y Italia 77 7 Toneladas 11000 5 -17 126 0 Y Malasia 70 15 Toneladas 4,667 8 -16 67 0 Y Tonga 62 0 Toneladas -65 -69 0 Guinea 56 3 Toneladas 18,667 -30 -77 0 Jamaica 56 33 Toneladas 1,697 20 106 93 0 Vanuatu 54 0 Toneladas -14 -57 0 Otros Africa 53 2 Toneladas 26500 0 Filipinas 45 18 Toneladas 2500 -7 0 15 0 Y Fiji 38 2 Toneladas 19000 27 3 0 Y Nueva Zelandia 37 12 Toneladas 3,083 -6 74 -54 0 Y Tierras Australes Francesas 32 0 Toneladas 10 0 Mauricio 30 3 Toneladas 10000 -64 173 0 Y República Dominicana 28 4 Toneladas 7000 -42 0 Hong Kong (RAEC) 23 11 Toneladas 2,091 -55 53 0 Y Fuente: Cálculos del CCI basados en estadísticas de COMTRADE 62 Anexo 3: Lista de países importadores de vainillina en el año 2006 Lista de los países importadores del producto seleccionado en 2006 Producto: 291241 vainillina (aldehído metilprotocatéquico) Importadores Total importado en 2006, en miles de US$ Cantidad importada en 2006 Unidad de medida Valor de unidad (US$/unidad) Crecimiento anual en valor entre 2002- 2006, % Crecimiento anual en cantidad entre 2002-2006, % Crecimiento anual en valor entre 2005- 2006, % Participación en las importaciones mundiales, % Información sobre las medidas arancelarias Estimación Mundo 155,158 12,439 Toneladas 12,474 8 1 3 100 Alemania 20,837 1,735 Toneladas 12010 13 7 18 13 BANA Estados Unidos de América 20,507 1,764 Toneladas 11,625 7 2 -8 13 BANA Suecia 10,260 707 Toneladas 14,512 16 8 21 7 BANA Italia 9,946 950 Toneladas 10,469 12 2 -4 6 BANA Suiza y Liechtenstein 5,971 417 Toneladas 14,319 21 14 34 4 BANA Japón 5,566 373 Toneladas 14,922 16 9 28 4 BANA Reino Unido 5,523 442 Toneladas 12,495 8 2 16 4 BANA Brasil 5,161 424 Toneladas 12,172 16 8 8 3 BANA Francia 4,920 348 Toneladas 14,138 -7 -13 -41 3 BANA Singapur 4,846 414 Toneladas 11,705 18 10 -27 3 BANA México 4,342 324 Toneladas 13,401 15 -5 3 3 BANA Países Bajos (Holanda) 3,546 256 Toneladas 13,852 -10 -15 6 2 BANA España 3,346 289 Toneladas 11,578 31 21 3 2 BANA Turquía 3,302 244 Toneladas 13,533 23 14 16 2 BANA Grecia 2,750 197 Toneladas 13,959 -7 6 10 2 BANA India 2,571 224 Toneladas 11,478 2 -4 37 2 BANA China 2,461 180 Toneladas 13,672 4 2 141 2 BANA Egipto 2,441 210 Toneladas 11,624 24 19 1 2 BANA Irán (República Islámica del) 2,352 191 Toneladas 12,314 20 16 -2 2 BANA Canadá 2,013 137 Toneladas 14,693 -3 -4 13 1 BANA Bélgica 1,946 141 Toneladas 13,801 -2 -11 -7 1 BANA Malasia 1,805 146 Toneladas 12,363 25 13 24 1 BANA Australia 1,686 125 Toneladas 13,488 7 -2 96 1 BANA Indonesia 1,645 174 Toneladas 9,454 11 7 -7 1 BANA Emiratos Árabes Unidos 1,586 133 Toneladas 11,925 43 53 42 1 BANA Austria 1,440 123 Toneladas 11,707 23 3 34 1 BANA Polonia 1,363 124 Toneladas 10,992 12 9 28 1 BANA Hungría 1,362 101 Toneladas 13,485 -27 -31 -30 1 BANA Filipinas 1,206 111 Toneladas 10,865 15 9 4 1 BANA Tailandia 1,055 81 Toneladas 13,025 24 17 1 1 BANA Ucrania 999 72 Toneladas 13,875 5 -12 15 1 BANA República de Corea 996 70 Toneladas 14,229 9 2 3 1 BANA Viet Nam 976 82 Toneladas 11,902 -13 -7 -35 1 BANA República Árabe Siria 916 77 Toneladas 11,896 7 0 30 1 BANA Bulgaria 756 46 Toneladas 16,435 339 75 13 0 BANA Hong Kong (RAEC) 679 56 Toneladas 12,125 -22 -28 -48 0 BANA Rumania 662 45 Toneladas 14,711 14 7 4 0 BANA Argentina 648 56 Toneladas 11,571 20 20 1 0 BANA Sudafrica 611 46 Toneladas 13,283 8 0 -3 0 BANA Fuente: Cálculos del CCI basados en estadísticas de COMTRADE 63 Anexo 4: Lista de países exportadores de vainillina en el 2006 Lista de los países exportadores del producto seleccionado en 2006 Producto: 291241 vainillina (aldehído metilprotocatéquico) Exportadores Total exportado en 2006, en miles de US$ Cantidad exportada en 2006 Unidad de medida Valor de unidad (US$/unidad) Crecimiento anual en valor entre 2002- 2006, % Crecimiento anual en cantidad entre 2002-2006, % Crecimiento anual en valor entre 2005- 2006, % Participación en las exportaciones mundiales, % Incluido en Comtrade en 2006 Estimación Mundo 126,700 10,638 Toneladas 11910 14 -5 20 100 China 82,896 6,945 Toneladas 11,936 24 15 25 65 Y Estados Unidos de América 14,223 1,237 Toneladas 11,498 -7 -12 21 11 Y Suecia 8,258 569 Toneladas 14,513 10 3 23 7 Y Alemania 7,669 546 Toneladas 14,046 17 11 43 6 Y Singapur 3,784 283 Toneladas 13,371 36 23 -3 3 Y Reino Unido 1,800 251 Toneladas 7,171 18 28 34 1 Y España 1,187 273 Toneladas 4,348 17 0 -54 1 Grecia 1,038 62 Toneladas 16,742 88 91 14 1 Y Italia 1,005 65 Toneladas 15,462 5 -12 -22 1 Y Austria 842 66 Toneladas 12,758 93 85 33 1 Y Hong Kong (RAEC) 768 69 Toneladas 11130 -3 -5 107 1 Y Países Bajos (Holanda) 652 84 Toneladas 7,762 7 11 -29 1 Y Bélgica 512 39 Toneladas 13,128 -20 -25 -38 0 Y Suiza y Liechtenstein 506 25 Toneladas 20240 7 7 -2 0 Y Federación de Rusia 282 19 Toneladas 14,842 31 -8 46 0 Y Malta 276 10 Toneladas 27600 -1 -6 -49 0 Y India 191 6 Toneladas 31,833 -30 -43 -75 0 Taiwan, Provincia de China 158 23 Toneladas 6870 74 198 123 0 Ucrania 87 5 Toneladas 17400 13 13 -6 0 Y Dinamarca 56 2 Toneladas 28000 -17 -30 -16 0 Y Eslovaquia 53 13 Toneladas 4,077 0 México 50 3 Toneladas 16,667 -56 -83 35 0 Y Australia 46 3 Toneladas 15,333 -20 -23 667 0 Y Estonia 45 3 Toneladas 15000 -1 -53 0 Y Polonia 44 4 Toneladas 11000 47 0 Y Sudafrica 39 2 Toneladas 19500 21 3 129 0 Y Jamaica 30 9 Toneladas 3,333 -11 -13 -51 0 Côte d'Ivoire (Costa de Marfil) 28 1 Toneladas 28000 600 0 Y Irlanda 26 10 Toneladas 2600 0 Y Tailandia 24 2 Toneladas 12000 -33 0 Y Portugal 19 1 Toneladas 19000 52 111 0 Y Lituania 16 1 Toneladas 16000 12 -3 -63 0 Y Guatemala 15 1 Toneladas 15000 -18 0 Indonesia 14 1 Toneladas 14000 41 15 -80 0 Y Canadá 13 1 Toneladas 13000 -77 -80 -41 0 Y Brasil 11 1 Toneladas 11000 37 -10 -8 0 Y Croacia 11 1 Toneladas 11000 -76 0 Y Trinidad y Tobago 10 1 Toneladas 10000 6 0 11 0 Fuente: Cálculos del CCI basados en estadísticas de COMTRADE 64 Anexo 5 Vanilla pompona de prueba (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.97 260095 2.442 32502 2 1.12 88122 0.828 20634 3 1.2 192901 1.811 22799 4 1.52 1319620 12.392 119209 5 2.04 1550 0.015 307 6 2.16 9299 0.087 1051 7 3.04 64010 0.601 3013 8 4.21 5640 0.053 456 9 5.33 74468 0.699 3574 10 6.03 59617 0.56 1666 11 6.85 20654 0.194 786 12 8.57 66139 0.621 3184 13 9.43 828746 7.782 24924 14 10.31 282341 2.651 7003 15 11 216536 2.033 11861 16 11.64 41170 0.387 3091 17 11.87 26485 0.249 2195 18 12.56 138180 1.298 10485 19 13.31 582260 5.468 46714 20 13.71 78374 0.736 5319 21 14.29 1271360 11.938 114438 22 14.79 3159121 29.665 295538 23 15.2 58852 0.553 6832 24 15.52 316696 2.974 25706 25 16 9574 0.09 1017 26 16.31 10683 0.1 1094 27 16.61 137110 1.288 12332 28 17.12 624646 5.866 56720 29 17.63 259461 2.436 20057 30 17.88 34046 0.32 4464 31 18.16 253784 2.383 15098 32 19.13 157708 1.481 7018 10649248 100 881087 Nota: Las señales en rojo indican corrección en la línea base. 0 . 9 7 1 . 1 2 1 . 2 0 1 . 5 2 2 . 0 4 2 . 1 6 3 . 0 4 4 . 2 1 5 . 3 3 6 . 0 3 6 . 8 5 8 . 5 7 9 . 4 3 1 0 . 3 1 1 1 . 0 0 1 1 . 6 4 1 1 . 8 7 1 2 . 5 6 1 3 . 3 1 1 3 . 7 1 1 4 . 2 9 1 4 . 7 9 1 5 . 2 0 1 5 . 5 2 1 6 . 0 0 1 6 . 3 1 1 6 . 6 1 1 7 . 1 2 1 7 . 6 3 1 7 . 8 8 1 8 . 1 6 1 9 . 1 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 65 Anexo 6 Vanilla pompona de prueba (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.97 264488 0.356 54905 2 1.03 204721 0.275 47876 3 1.21 770936 1.037 79486 4 1.52 1112751 1.497 129224 5 1.75 687124 0.924 38318 6 2.09 380510 0.512 20315 7 3.19 1380170 1.856 39553 8 4.19 115341 0.155 5010 9 4.61 88805 0.119 4900 10 5.33 1133850 1.525 68053 11 6.84 83960 0.113 2176 12 8.57 1292342 1.738 58055 13 9.25 3321385 4.468 88387 14 10.37 104710 0.141 4000 15 11.04 241644 0.325 11701 16 11.65 114531 0.154 8428 17 11.83 71926 0.097 6520 18 12.56 193544 0.26 16330 19 13.29 1040327 1.399 67417 20 13.68 1835573 2.469 122740 21 14.4 24274192 32.652 1373975 22 14.85 19665864 26.453 1373210 23 15.21 447120 0.601 62787 24 15.52 7580154 10.196 680710 25 15.92 139270 0.187 13164 26 16.28 4780 0.006 653 27 16.61 3172851 4.268 304140 28 16.84 57300 0.077 6688 29 17.32 1722140 2.316 78922 30 17.63 470444 0.633 39955 31 18.16 2200361 2.96 174105 32 18.83 13102 0.018 1439 33 19.13 156617 0.211 12046 74342833 100 4995188 0 . 9 7 1 . 0 3 1 . 2 1 1 . 5 2 1 . 7 5 2 . 0 9 3 . 1 9 4 . 1 9 4 . 6 1 5 . 3 3 6 . 8 4 8 . 5 7 9 . 2 5 1 0 . 3 7 1 1 . 0 4 1 1 . 6 5 1 1 . 8 3 1 2 . 5 6 1 3 . 2 9 1 3 . 6 8 1 4 . 4 0 1 4 . 8 5 1 5 . 2 1 1 5 . 5 2 1 5 . 9 2 1 6 . 2 8 1 6 . 6 1 1 6 . 8 4 1 7 . 3 2 1 7 . 6 3 1 8 . 1 6 1 8 . 8 3 1 9 . 1 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 66 Anexo 7 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 1.5 mL Viscozima, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 905098 5.062 208105 2 1.21 5560 0.031 2050 3 1.39 393544 2.201 41140 4 1.53 1421461 7.95 282838 5 2.35 3720 0.021 498 6 3.16 40857 0.229 2191 7 4.2 99892 0.559 2906 8 5.29 524496 2.933 21334 9 5.84 17360 0.097 684 10 6.76 6846 0.038 404 11 7.28 40173 0.225 1580 12 8.49 72204 0.404 3720 13 9.15 300780 1.682 12160 14 9.87 305550 1.709 7599 15 10.92 411424 2.301 23006 16 11.76 21280 0.119 1875 17 12.49 180210 1.008 15079 18 13.21 747099 4.178 58728 19 13.69 45985 0.257 3274 20 14.23 666153 3.726 61230 21 14.69 3638455 20.348 353785 22 15.13 27307 0.153 4410 23 15.39 931844 5.211 81523 24 15.91 9616 0.054 1188 25 16.2 19686 0.11 1770 26 16.59 14519 0.081 1629 27 16.75 13741 0.077 1474 28 17.44 414824 2.32 30820 29 17.73 392149 2.193 36678 30 18.09 6052040 33.847 515029 31 18.96 156827 0.877 10149 17880700 100 1788856 1 . 0 4 1 . 2 1 1 . 3 9 1 . 5 3 2 . 3 5 3 . 1 6 4 . 2 0 5 . 2 9 5 . 8 4 6 . 7 6 7 . 2 8 8 . 4 9 9 . 1 5 9 . 8 7 1 0 . 9 2 1 1 . 7 6 1 2 . 4 9 1 3 . 2 1 1 3 . 6 9 1 4 . 2 3 1 4 . 6 9 1 5 . 1 3 1 5 . 3 9 1 5 . 9 1 1 6 . 2 0 1 6 . 5 9 1 6 . 7 5 1 7 . 4 4 1 7 . 7 3 1 8 . 0 9 1 8 . 9 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 67 Anexo 8 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 1.5 mL Viscozima, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 2423613 2.866 455130 2 1.4 792493 0.937 85929 3 1.53 1539005 1.82 337223 4 2.08 266875 0.316 14148 5 2.35 175216 0.207 10185 6 3.16 1119667 1.324 44572 7 4.16 296377 0.35 7860 8 4.55 121030 0.143 6763 9 5.29 6935430 8.2 453054 10 6.72 203450 0.241 4606 11 8.49 1476575 1.746 70938 12 9.13 1315960 1.556 58165 13 9.81 502111 0.594 15159 14 10.49 145404 0.172 8952 15 10.96 313757 0.371 15596 16 11.76 92417 0.109 6124 17 12.49 305389 0.361 24537 18 13.21 943822 1.116 67595 19 13.44 320236 0.379 38193 20 13.65 811503 0.959 53363 21 14.29 19705238 23.299 1369895 22 14.76 19299102 22.818 1369171 23 15.47 21780494 25.752 1368075 24 15.81 56440 0.067 3560 25 16.19 16300 0.019 2250 26 16.53 54180 0.064 6575 27 16.75 288560 0.341 29600 28 17.19 240041 0.284 16758 29 17.43 771441 0.912 52935 30 17.73 156759 0.185 15435 31 18.09 1726777 2.042 116401 32 18.61 5340 0.006 775 33 18.95 375734 0.444 24603 84576736 100 6154125 1 . 0 4 1 . 4 0 1 . 5 3 2 . 0 8 2 . 3 5 3 . 1 6 4 . 1 6 4 . 5 5 5 . 2 9 6 . 7 2 8 . 4 9 9 . 1 3 9 . 8 1 1 0 . 4 9 1 0 . 9 6 1 1 . 7 6 1 2 . 4 9 1 3 . 2 1 1 3 . 4 4 1 3 . 6 5 1 4 . 2 9 1 4 . 7 6 1 5 . 4 7 1 5 . 8 1 1 6 . 1 9 1 6 . 5 3 1 6 . 7 5 1 7 . 1 9 1 7 . 4 3 1 7 . 7 3 1 8 . 0 9 1 8 . 6 1 1 8 . 9 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 68 Anexo 9 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 1.5 mL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 671534 3.85 157221 2 1.21 14020 0.08 4316 3 1.4 207652 1.19 45649 4 1.44 198624 1.139 47319 5 1.52 906609 5.198 98309 6 1.64 12300 0.071 1767 7 2.32 5350 0.031 582 8 3.13 65015 0.373 3365 9 3.52 27169 0.156 1599 10 4.28 23981 0.137 916 11 5.37 344768 1.977 20630 12 6.23 75114 0.431 941 13 8.61 84357 0.484 4255 14 9.2 204943 1.175 10386 15 9.93 307536 1.763 7712 16 10.97 395284 2.266 18398 17 11.79 27811 0.159 1944 18 12.52 177966 1.02 14619 19 13.25 703093 4.031 55842 20 13.75 286151 1.64 20318 21 14.27 368599 2.113 33692 22 14.71 3505418 20.096 335494 23 15.4 1158505 6.642 100602 24 15.93 10053 0.058 1265 25 16.19 15820 0.091 1489 26 16.61 6459 0.037 1046 27 16.75 12966 0.074 1421 28 17.03 79428 0.455 6596 29 17.48 208747 1.197 18054 30 17.75 816972 4.684 74202 31 18.12 6343136 36.365 533945 32 18.95 177633 1.018 12120 17443013 100 1636014 1 . 0 4 1 . 2 1 1 . 4 0 1 . 4 4 1 . 5 2 1 . 6 4 2 . 3 2 3 . 1 3 3 . 5 2 4 . 2 8 5 . 3 7 6 . 2 3 8 . 6 1 9 . 2 0 9 . 9 3 1 0 . 9 7 1 1 . 7 9 1 2 . 5 2 1 3 . 2 5 1 3 . 7 5 1 4 . 2 7 1 4 . 7 1 1 5 . 4 0 1 5 . 9 3 1 6 . 1 9 1 6 . 6 1 1 6 . 7 5 1 7 . 0 3 1 7 . 4 8 1 7 . 7 5 1 8 . 1 2 1 8 . 9 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 69 Anexo 10 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 1.5 mL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 959703 1.252 271781 2 1.15 719520 0.939 98560 3 1.41 489726 0.639 57622 4 1.53 726588 0.948 112803 5 2.29 264129 0.345 10362 6 3.24 980346 1.279 43604 7 4.29 138690 0.181 4051 8 4.65 42719 0.056 2667 9 5.37 7113100 9.282 455772 10 6.6 343650 0.448 8720 11 8.6 1663846 2.171 80835 12 9.2 1032548 1.347 51520 13 9.88 520860 0.68 15455 14 10.56 154337 0.201 9640 15 10.99 308376 0.402 15414 16 11.79 80477 0.105 6089 17 12.52 310981 0.406 25413 18 13.25 668849 0.873 52413 19 13.6 734213 0.958 51692 20 14.27 13119080 17.12 1195991 21 14.77 18937302 24.712 1373856 22 15.49 23750262 30.993 1372775 23 16.19 37890 0.049 3139 24 16.75 464926 0.607 38093 25 17.04 173196 0.226 8928 26 17.47 374574 0.489 26637 27 17.75 259885 0.339 22542 28 18.11 1731574 2.26 116851 29 18.6 6120 0.008 920 30 18.95 524004 0.684 38940 76631471 100 5573085 1 . 0 4 1 . 1 5 1 . 4 1 1 . 5 3 2 . 2 9 3 . 2 4 4 . 2 9 4 . 6 5 5 . 3 7 6 . 6 0 8 . 6 0 9 . 2 0 9 . 8 8 1 0 . 5 6 1 0 . 9 9 1 1 . 7 9 1 2 . 5 2 1 3 . 2 5 1 3 . 6 0 1 4 . 2 7 1 4 . 7 7 1 5 . 4 9 1 6 . 1 9 1 6 . 7 5 1 7 . 0 4 1 7 . 4 7 1 7 . 7 5 1 8 . 1 1 1 8 . 6 0 1 8 . 9 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 70 Anexo 11 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima, 4 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.03 665838 5.876 117744 2 1.2 7111 0.063 2978 3 1.25 30648 0.27 4510 4 1.49 1394591 12.306 173856 5 2.11 12360 0.109 1395 6 3.16 48756 0.43 1925 7 4.2 22963 0.203 875 8 5.31 104539 0.922 5294 9 5.88 53944 0.476 1486 10 6.85 28816 0.254 868 11 8.57 66619 0.588 3030 12 9.2 470491 4.152 21470 13 9.43 333318 2.941 20158 14 10.11 262553 2.317 6098 15 10.96 253193 2.234 13651 16 11.67 17566 0.155 1552 17 11.83 21276 0.188 1698 18 12.51 154020 1.359 11776 19 13.24 626732 5.531 50499 20 13.63 79276 0.7 5219 21 14.24 1222273 10.786 108037 22 14.72 3325282 29.344 320753 23 15.13 52876 0.467 6168 24 15.43 392493 3.464 33617 25 15.88 15716 0.139 1263 26 16.2 15947 0.141 1534 27 16.52 135140 1.193 9666 28 17.21 99000 0.874 6382 29 17.49 315954 2.788 23207 30 17.79 70760 0.624 7076 31 18.16 893720 7.887 59034 32 18.97 138378 1.221 8046 11332149 100 1030865 1 . 0 3 1 . 2 0 1 . 2 5 1 . 4 9 2 . 1 1 3 . 1 6 4 . 2 0 5 . 3 1 5 . 8 8 6 . 8 5 8 . 5 7 9 . 2 0 9 . 4 3 1 0 . 1 1 1 0 . 9 6 1 1 . 6 7 1 1 . 8 3 1 2 . 5 1 1 3 . 2 4 1 3 . 6 3 1 4 . 2 4 1 4 . 7 2 1 5 . 1 3 1 5 . 4 3 1 5 . 8 8 1 6 . 2 0 1 6 . 5 2 1 7 . 2 1 1 7 . 4 9 1 7 . 7 9 1 8 . 1 6 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 71 Anexo 12 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima, 4 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.03 1094223 1.418 213961 2 1.19 312971 0.405 78877 3 1.27 420366 0.545 65485 4 1.49 878810 1.138 192805 5 1.69 697216 0.903 43488 6 2.11 217739 0.282 18385 7 3.17 1368610 1.773 38079 8 4.19 87164 0.113 4475 9 4.57 78228 0.101 4461 10 5.31 2038280 2.641 109810 11 6.32 0 0 0 12 6.83 35610 0.046 1547 13 7.61 0 0 0 14 8.55 1371234 1.776 53718 15 9.19 3252678 4.214 84297 16 9.88 17174 0.022 1737 17 10.44 49665 0.064 3087 18 11.03 239968 0.311 12047 19 11.8 121178 0.157 5675 20 12.52 221969 0.288 18634 21 13.24 1167481 1.512 77121 22 13.61 1940598 2.514 123665 23 14.35 24296604 31.476 1367366 24 14.79 19668030 25.48 1366151 25 15.12 225150 0.292 34496 26 15.43 10442593 13.528 1029285 27 15.83 195550 0.253 18763 28 16.2 136509 0.177 12275 29 16.51 2457200 3.183 217678 30 16.73 80200 0.104 8996 31 17.21 1330336 1.723 73477 32 17.49 540375 0.7 42629 33 18.04 1867846 2.42 132920 34 18.96 339534 0.44 25505 77191089 100 5480895 1 . 0 3 1 . 1 9 1 . 2 7 1 . 4 9 1 . 6 9 2 . 1 1 3 . 1 7 4 . 1 9 4 . 5 7 5 . 3 1 6 . 3 2 6 . 8 3 7 . 6 1 8 . 5 5 9 . 1 9 9 . 8 8 1 0 . 4 4 1 1 . 0 3 1 1 . 8 0 1 2 . 5 2 1 3 . 2 4 1 3 . 6 1 1 4 . 3 5 1 4 . 7 9 1 5 . 1 2 1 5 . 4 3 1 5 . 8 3 1 6 . 2 0 1 6 . 5 1 1 6 . 7 3 1 7 . 2 1 1 7 . 4 9 1 8 . 0 4 1 8 . 9 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 72 Anexo 13 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.03 662999 5.824 107219 2 1.21 9505 0.083 2517 3 1.29 22074 0.194 4828 4 1.51 1348010 11.84 157054 5 2.11 11380 0.1 1451 6 3.16 43550 0.383 1970 7 4.19 41320 0.363 1578 8 5.28 173895 1.527 9666 9 5.96 60409 0.531 1555 10 6.81 49814 0.438 1123 11 8.53 64614 0.568 3047 12 9.19 735997 6.465 21065 13 10.15 251326 2.208 5938 14 10.93 291413 2.56 16054 15 11.8 24968 0.219 1639 16 12.49 169860 1.492 12974 17 13.24 646701 5.68 52898 18 13.63 84938 0.746 5058 19 14.23 1163891 10.223 103768 20 14.71 3461866 30.408 329352 21 15.41 463143 4.068 39675 22 15.83 17881 0.157 1413 23 16.19 16079 0.141 1570 24 16.51 85359 0.75 6086 25 17.11 84736 0.744 5212 26 17.47 348900 3.065 25608 27 17.77 50261 0.441 5797 28 18.13 866395 7.61 58143 29 18.95 133547 1.173 8222 11384831 100 992480 1 . 0 3 1 . 2 1 1 . 2 9 1 . 5 1 2 . 1 1 3 . 1 6 4 . 1 9 5 . 2 8 5 . 9 6 6 . 8 1 8 . 5 3 9 . 1 9 1 0 . 1 5 1 0 . 9 3 1 1 . 8 0 1 2 . 4 9 1 3 . 2 4 1 3 . 6 3 1 4 . 2 3 1 4 . 7 1 1 5 . 4 1 1 5 . 8 3 1 6 . 1 9 1 6 . 5 1 1 7 . 1 1 1 7 . 4 7 1 7 . 7 7 1 8 . 1 3 1 8 . 9 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 73 Anexo 14 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.03 1111630 1.395 194421 2 1.2 319764 0.401 74630 3 1.28 364354 0.457 58269 4 1.51 870989 1.093 174128 5 1.67 533069 0.669 35206 6 2.11 227866 0.286 19794 7 3.16 1380464 1.732 42480 8 4.16 132167 0.166 5840 9 4.53 100491 0.126 5420 10 5.29 3643860 4.572 209527 11 6.79 96080 0.121 2659 12 8.52 1356715 1.702 57606 13 9.16 3056980 3.836 83524 14 10.13 21493 0.027 1506 15 10.45 64496 0.081 3894 16 10.99 268184 0.337 13191 17 11.77 84230 0.106 5661 18 12.51 253533 0.318 20585 19 13.23 1260864 1.582 86055 20 13.61 1884021 2.364 117857 21 14.32 23889376 29.975 1371199 22 14.77 19758451 24.792 1370440 23 15.11 90340 0.113 14926 24 15.41 13247802 16.623 1300494 25 15.81 225140 0.282 22731 26 16.17 176506 0.221 14771 27 16.49 1712920 2.149 142060 28 16.73 116020 0.146 15821 29 17.2 1154013 1.448 65877 30 17.45 629147 0.789 46728 31 18 1391514 1.746 88388 32 18.6 4420 0.006 620 33 18.93 270728 0.34 18700 79697627 100 5685008 1 . 0 3 1 . 2 0 1 . 2 8 1 . 5 1 1 . 6 7 2 . 1 1 3 . 1 6 4 . 1 6 4 . 5 3 5 . 2 9 6 . 7 9 8 . 5 2 9 . 1 6 1 0 . 1 3 1 0 . 4 5 1 0 . 9 9 1 1 . 7 7 1 2 . 5 1 1 3 . 2 3 1 3 . 6 1 1 4 . 3 2 1 4 . 7 7 1 5 . 1 1 1 5 . 4 1 1 5 . 8 1 1 6 . 1 7 1 6 . 4 9 1 6 . 7 3 1 7 . 2 0 1 7 . 4 5 1 8 . 0 0 1 8 . 6 0 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 74 Anexo 15 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima, 16 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 672676 5.859 107916 2 1.2 7960 0.069 2316 3 1.31 9760 0.085 2782 4 1.51 1382913 12.046 166108 5 2.11 7740 0.067 1187 6 3.17 46880 0.408 1837 7 4.19 51220 0.446 1641 8 5.29 180414 1.571 8963 9 5.84 51191 0.446 1284 10 6.84 53654 0.467 1185 11 8.56 72829 0.634 3285 12 9.19 446158 3.886 19360 13 9.4 280125 2.44 17566 14 9.96 250940 2.186 6070 15 10.95 278787 2.428 14812 16 11.8 25360 0.221 1625 17 12.51 165170 1.439 12715 18 13.24 654921 5.705 52194 19 13.63 78345 0.682 4841 20 14.23 1182945 10.304 103015 21 14.72 3520730 30.667 335026 22 15.41 453288 3.948 38853 23 15.83 15161 0.132 1222 24 16.2 13436 0.117 1411 25 16.52 99043 0.863 6228 26 17.19 91612 0.798 5953 27 17.45 374331 3.261 27934 28 17.79 45170 0.393 6072 29 18.13 842199 7.336 56256 30 18.93 125716 1.095 7497 11480674 100 1017154 1 . 0 4 1 . 2 0 1 . 3 1 1 . 5 1 2 . 1 1 3 . 1 7 4 . 1 9 5 . 2 9 5 . 8 4 6 . 8 4 8 . 5 6 9 . 1 9 9 . 4 0 9 . 9 6 1 0 . 9 5 1 1 . 8 0 1 2 . 5 1 1 3 . 2 4 1 3 . 6 3 1 4 . 2 3 1 4 . 7 2 1 5 . 4 1 1 5 . 8 3 1 6 . 2 0 1 6 . 5 2 1 7 . 1 9 1 7 . 4 5 1 7 . 7 9 1 8 . 1 3 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 75 Anexo 16 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima, 16 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 1069902 1.336 199130 2 1.19 492881 0.616 85373 3 1.28 252982 0.316 47476 4 1.49 848489 1.06 174389 5 1.63 607076 0.758 57078 6 2.11 261624 0.327 17920 7 3.17 1315426 1.643 38985 8 4.16 123504 0.154 4426 9 4.57 63824 0.08 3874 10 5.29 3551580 4.436 187678 11 6.81 71980 0.09 2346 12 8.55 1407069 1.757 53783 13 9.16 2994105 3.74 78593 14 9.85 20460 0.026 1953 15 10.45 32370 0.04 1884 16 11.01 254116 0.317 12085 17 11.79 83080 0.104 5468 18 12.51 241498 0.302 20028 19 13.24 1256868 1.57 81990 20 13.61 1902407 2.376 115293 21 14.33 24263841 30.305 1369088 22 14.79 19976996 24.95 1367998 23 15.11 70010 0.087 10973 24 15.41 13119392 16.386 1284742 25 15.83 193320 0.241 19678 26 16.17 156530 0.196 13066 27 16.51 1773225 2.215 139615 28 16.73 92200 0.115 11684 29 17.2 1222328 1.527 70323 30 17.43 733777 0.916 52679 31 18 1370234 1.711 88051 32 18.59 3630 0.005 516 33 18.93 239798 0.299 16408 80066522 100 5634573 1 . 0 4 1 . 1 9 1 . 2 8 1 . 4 9 1 . 6 3 2 . 1 1 3 . 1 7 4 . 1 6 4 . 5 7 5 . 2 9 6 . 8 1 8 . 5 5 9 . 1 6 9 . 8 5 1 0 . 4 5 1 1 . 0 1 1 1 . 7 9 1 2 . 5 1 1 3 . 2 4 1 3 . 6 1 1 4 . 3 3 1 4 . 7 9 1 5 . 1 1 1 5 . 4 1 1 5 . 8 3 1 6 . 1 7 1 6 . 5 1 1 6 . 7 3 1 7 . 2 0 1 7 . 4 3 1 8 . 0 0 1 8 . 5 9 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 76 Anexo 17 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 600 μL Viscozima, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.63 2250 0.016 102 2 1.04 776209 5.52 180161 3 1.36 206190 1.466 35929 4 1.44 101168 0.719 33490 5 1.49 1246371 8.863 197981 6 2.33 4600 0.033 650 7 3.24 48901 0.348 1968 8 4.32 52218 0.371 1618 9 5.37 254146 1.807 13225 10 6.01 57740 0.411 1496 11 6.96 59373 0.422 1200 12 8.63 74404 0.529 3218 13 9.24 376173 2.675 18086 14 9.47 465274 3.309 15901 15 9.89 48940 0.348 1662 16 10.97 351908 2.502 18931 17 11.83 27933 0.199 1874 18 12.53 189128 1.345 14028 19 13.27 704700 5.011 54046 20 13.65 91946 0.654 5359 21 14.27 1034753 7.358 88852 22 14.73 3576410 25.433 340757 23 15.43 700132 4.979 57466 24 15.91 41620 0.296 2940 25 16.21 50312 0.358 3462 26 16.55 102572 0.729 4622 27 17.19 69249 0.492 4804 28 17.49 372615 2.65 28601 29 17.8 186227 1.324 16972 30 18.15 2638237 18.761 213227 31 18.97 150593 1.071 9031 14062292 100 1371659 0 . 6 3 1 . 0 4 1 . 3 6 1 . 4 4 1 . 4 9 2 . 3 3 3 . 2 4 4 . 3 2 5 . 3 7 6 . 0 1 6 . 9 6 8 . 6 3 9 . 2 4 9 . 4 7 9 . 8 9 1 0 . 9 7 1 1 . 8 3 1 2 . 5 3 1 3 . 2 7 1 3 . 6 5 1 4 . 2 7 1 4 . 7 3 1 5 . 4 3 1 5 . 9 1 1 6 . 2 1 1 6 . 5 5 1 7 . 1 9 1 7 . 4 9 1 7 . 8 0 1 8 . 1 5 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 77 Anexo 18 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 600 μL Viscozima, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.43 2230 0.003 108 2 1.04 1232750 1.485 355223 3 1.15 726629 0.876 107861 4 1.36 612394 0.738 77288 5 1.49 536552 0.647 161605 6 1.59 358720 0.432 59841 7 2.31 270513 0.326 10181 8 3.25 1132030 1.364 37475 9 3.87 70016 0.084 3926 10 4.29 100793 0.121 4380 11 4.69 62024 0.075 3980 12 5.37 5337950 6.432 286457 13 6.39 51358 0.062 2086 14 6.91 83207 0.1 3017 15 8.61 1440429 1.736 57882 16 9.21 2777274 3.346 74900 17 9.88 29140 0.035 2723 18 10.57 14710 0.018 1577 19 11 274106 0.33 13566 20 11.81 85492 0.103 5768 21 12.53 269311 0.325 21650 22 13.25 1124605 1.355 74382 23 13.64 1574125 1.897 88553 24 14.35 23076499 27.806 1370982 25 14.8 19394035 23.369 1370215 26 15.11 11940 0.014 1125 27 15.48 18631672 22.45 1369064 28 15.84 121100 0.146 11877 29 16.2 28713 0.035 3725 30 16.53 553068 0.666 59520 31 16.76 328316 0.396 31455 32 17.21 492835 0.594 32325 33 17.48 585398 0.705 44785 34 18.11 1243941 1.499 61998 35 18.97 357407 0.431 26338 82991282 100 5837838 0 . 4 3 1 . 0 4 1 . 1 5 1 . 3 6 1 . 4 9 1 . 5 9 2 . 3 1 3 . 2 5 3 . 8 7 4 . 2 9 4 . 6 9 5 . 3 7 6 . 3 9 6 . 9 1 8 . 6 1 9 . 2 1 9 . 8 8 1 0 . 5 7 1 1 . 0 0 1 1 . 8 1 1 2 . 5 3 1 3 . 2 5 1 3 . 6 4 1 4 . 3 5 1 4 . 8 0 1 5 . 1 1 1 5 . 4 8 1 5 . 8 4 1 6 . 2 0 1 6 . 5 3 1 6 . 7 6 1 7 . 2 1 1 7 . 4 8 1 8 . 1 1 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 78 Anexo 19 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 150 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.75 1000 0.008 101 2 1.03 704395 5.701 142704 3 1.21 34420 0.279 8563 4 1.44 208399 1.687 44857 5 1.52 977176 7.908 135994 6 2.16 14020 0.113 1502 7 3.15 43975 0.356 2061 8 4.17 40154 0.325 1332 9 5.29 380358 3.078 15317 10 6.03 28738 0.233 962 11 6.76 13630 0.11 689 12 7.29 16951 0.137 633 13 8.52 72207 0.584 3441 14 9.17 469871 3.803 15861 15 10.25 281268 2.276 6629 16 10.93 330312 2.673 18164 17 11.79 30836 0.25 2152 18 12.51 180883 1.464 13722 19 13.24 667175 5.399 55425 20 13.61 156785 1.269 8316 21 14.24 1033435 8.363 93265 22 14.72 3554728 28.768 342143 23 15.12 54426 0.44 6774 24 15.43 615616 4.982 51339 25 15.88 41888 0.339 2750 26 16.2 54393 0.44 3510 27 16.61 48283 0.391 3612 28 16.75 37674 0.305 3464 29 17.2 68658 0.556 5051 30 17.48 324591 2.627 24450 31 17.79 158183 1.28 14315 32 18.15 1544656 12.501 116610 33 18.97 167613 1.356 10363 12356697 100 1156071 0 . 7 5 1 . 0 3 1 . 2 1 1 . 4 4 1 . 5 2 2 . 1 6 3 . 1 5 4 . 1 7 5 . 2 9 6 . 0 3 6 . 7 6 7 . 2 9 8 . 5 2 9 . 1 7 1 0 . 2 5 1 0 . 9 3 1 1 . 7 9 1 2 . 5 1 1 3 . 2 4 1 3 . 6 1 1 4 . 2 4 1 4 . 7 2 1 5 . 1 2 1 5 . 4 3 1 5 . 8 8 1 6 . 2 0 1 6 . 6 1 1 6 . 7 5 1 7 . 2 0 1 7 . 4 8 1 7 . 7 9 1 8 . 1 5 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 79 Anexo 20 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 150 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.27 1300 0.002 100 2 1.03 1185202 1.446 253812 3 1.2 662750 0.809 88593 4 1.44 467191 0.57 83780 5 1.51 952810 1.163 111611 6 2.13 282372 0.345 20129 7 3.16 1177078 1.436 43734 8 3.75 114052 0.139 6033 9 4.12 154221 0.188 6682 10 4.53 112719 0.138 5925 11 5.29 5251660 6.409 323577 12 6.73 160440 0.196 4218 13 8.53 1390369 1.697 63581 14 9.16 2338165 2.853 68317 15 9.81 13970 0.017 1585 16 10.47 94700 0.116 4139 17 10.96 307655 0.375 14767 18 11.77 90331 0.11 6347 19 12.52 325706 0.397 25009 20 13.24 1173092 1.432 86339 21 13.6 2589403 3.16 191854 22 14.33 22763652 27.778 1371013 23 14.79 19778321 24.135 1370276 24 15.12 79670 0.097 14371 25 15.45 17205371 20.996 1369193 26 15.84 163220 0.199 17459 27 16.2 131623 0.161 14950 28 16.53 188140 0.23 21375 29 16.75 414911 0.506 38581 30 17.21 521392 0.636 36391 31 17.47 468909 0.572 36020 32 17.79 47703 0.058 6003 33 18.04 734428 0.896 41607 34 18.41 156984 0.192 10405 35 18.96 447766 0.546 34136 81947276 100 5791912 0 . 2 7 1 . 0 3 1 . 2 0 1 . 4 4 1 . 5 1 2 . 1 3 3 . 1 6 3 . 7 5 4 . 1 2 4 . 5 3 5 . 2 9 6 . 7 3 8 . 5 3 9 . 1 6 9 . 8 1 1 0 . 4 7 1 0 . 9 6 1 1 . 7 7 1 2 . 5 2 1 3 . 2 4 1 3 . 6 0 1 4 . 3 3 1 4 . 7 9 1 5 . 1 2 1 5 . 4 5 1 5 . 8 4 1 6 . 2 0 1 6 . 5 3 1 6 . 7 5 1 7 . 2 1 1 7 . 4 7 1 7 . 7 9 1 8 . 0 4 1 8 . 4 1 1 8 . 9 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 80 Anexo 21 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 300 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.2 770 0.005 118 2 0.84 470 0.003 157 3 1.03 741032 5.278 162375 4 1.2 10240 0.073 1704 5 1.45 259001 1.845 33754 6 1.52 989543 7.047 160942 7 2.25 9830 0.07 1501 8 3.07 42560 0.303 1964 9 4.07 38140 0.272 1377 10 5.24 453081 3.227 17916 11 5.89 18045 0.129 545 12 6.73 8987 0.064 496 13 7.27 24266 0.173 850 14 8.52 74076 0.528 3301 15 9.16 318703 2.27 12233 16 10.04 293848 2.093 6593 17 10.96 377361 2.688 19615 18 11.83 25064 0.179 1890 19 12.55 183713 1.308 14407 20 13.28 684836 4.877 56546 21 13.68 150633 1.073 7466 22 14.27 871787 6.209 76963 23 14.73 3656673 26.042 351358 24 15.43 799075 5.691 67689 25 15.93 34192 0.244 2618 26 16.23 58688 0.418 3479 27 16.63 30509 0.217 3274 28 16.76 32596 0.232 3247 29 17.04 417328 2.972 39314 30 17.48 319958 2.279 25319 31 17.79 278883 1.986 24425 32 18.15 2677075 19.066 218010 33 18.97 160260 1.141 10415 14041223 100 1331861 0 . 8 4 1 . 0 3 1 . 2 0 1 . 4 5 1 . 5 2 2 . 2 5 3 . 0 7 4 . 0 7 5 . 2 4 5 . 8 9 6 . 7 3 7 . 2 7 8 . 5 2 9 . 1 6 1 0 . 0 4 1 0 . 9 6 1 1 . 8 3 1 2 . 5 5 1 3 . 2 8 1 3 . 6 8 1 4 . 2 7 1 4 . 7 3 1 5 . 4 3 1 5 . 9 3 1 6 . 2 3 1 6 . 6 3 1 6 . 7 6 1 7 . 0 4 1 7 . 4 8 1 7 . 7 9 1 8 . 1 5 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 81 Anexo 22 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 300 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 1205601 1.454 297735 2 1.16 706121 0.852 98870 3 1.43 516812 0.623 64848 4 1.52 895670 1.08 126450 5 2.24 350939 0.423 15836 6 3.09 1165703 1.406 43511 7 4.03 204762 0.247 6234 8 4.44 110638 0.133 5805 9 5.24 6525802 7.871 380844 10 6.68 289631 0.349 5907 11 8.52 1439672 1.736 62046 12 9.16 1397748 1.686 57557 13 9.87 355110 0.428 13417 14 10.33 257944 0.311 9660 15 11 326724 0.394 15401 16 11.81 84332 0.102 5997 17 12.55 328899 0.397 24954 18 13.27 896375 1.081 68834 19 13.63 2016489 2.432 141337 20 14.35 21487737 25.916 1373617 21 14.8 19509336 23.53 1372833 22 15.13 16690 0.02 3722 23 15.49 20023180 24.149 1371634 24 15.84 56210 0.068 4438 25 16.21 95792 0.116 10804 26 16.76 425077 0.513 37631 27 17.05 363474 0.438 23341 28 17.47 458555 0.553 35752 29 17.79 68021 0.082 7414 30 18.13 914656 1.103 49980 31 18.97 420092 0.507 32442 82913792 100 5768851 1 . 0 4 1 . 1 6 1 . 4 3 1 . 5 2 2 . 2 4 3 . 0 9 4 . 0 3 4 . 4 4 5 . 2 4 6 . 6 8 8 . 5 2 9 . 1 6 9 . 8 7 1 0 . 3 3 1 1 . 0 0 1 1 . 8 1 1 2 . 5 5 1 3 . 2 7 1 3 . 6 3 1 4 . 3 5 1 4 . 8 0 1 5 . 1 3 1 5 . 4 9 1 5 . 8 4 1 6 . 2 1 1 6 . 7 6 1 7 . 0 5 1 7 . 4 7 1 7 . 7 9 1 8 . 1 3 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 82 Anexo 23 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.03 725399 5.638 157454 2 1.19 16620 0.129 3155 3 1.45 226793 1.763 39052 4 1.49 1094816 8.508 148470 5 2.25 10900 0.085 1359 6 3.13 44736 0.348 1733 7 4.12 40503 0.315 1397 8 5.27 280898 2.183 14821 9 5.89 39956 0.311 1088 10 6.8 43784 0.34 923 11 8.49 77368 0.601 3158 12 9.13 372001 2.891 12917 13 10.04 291383 2.265 6497 14 10.92 341127 2.651 17685 15 11.77 27305 0.212 1825 16 12.49 184804 1.436 13816 17 13.23 680790 5.291 53847 18 13.63 149620 1.163 7869 19 14.24 920514 7.154 79064 20 14.71 3672127 28.538 345423 21 15.41 693502 5.39 59305 22 15.91 12940 0.101 1113 23 16.2 18273 0.142 1750 24 16.63 32052 0.249 1774 25 17.2 38324 0.298 3173 26 17.48 284779 2.213 23072 27 17.76 240789 1.871 21295 28 18.12 2135993 16.6 169507 29 18.93 169225 1.315 10423 12867321 100 1202965 1 . 0 3 1 . 1 9 1 . 4 5 1 . 4 9 2 . 2 5 3 . 1 3 4 . 1 2 5 . 2 7 5 . 8 9 6 . 8 0 8 . 4 9 9 . 1 3 1 0 . 0 4 1 0 . 9 2 1 1 . 7 7 1 2 . 4 9 1 3 . 2 3 1 3 . 6 3 1 4 . 2 4 1 4 . 7 1 1 5 . 4 1 1 5 . 9 1 1 6 . 2 0 1 6 . 6 3 1 7 . 2 0 1 7 . 4 8 1 7 . 7 6 1 8 . 1 2 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 83 Anexo 24 Vanilla pompona de prueba (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.03 1197709 1.41 280314 2 1.17 669894 0.789 92835 3 1.41 286495 0.337 63987 4 1.45 157384 0.185 68475 5 1.49 482496 0.568 140837 6 1.59 515469 0.607 47167 7 2.21 300442 0.354 14192 8 3.15 1189474 1.401 39365 9 3.79 65868 0.078 4769 10 4.11 132486 0.156 5596 11 4.52 91426 0.108 4652 12 5.27 6079989 7.16 326960 13 6.71 293784 0.346 5864 14 8.48 1470858 1.732 57702 15 9.12 2054186 2.419 60048 16 9.81 73961 0.087 4445 17 10.23 59618 0.07 2517 18 10.93 289935 0.341 14169 19 11.76 88051 0.104 5923 20 12.49 348864 0.411 25449 21 13.23 1006040 1.185 71449 22 13.59 2421534 2.852 162898 23 14.32 22706828 26.74 1373373 24 14.77 19727148 23.231 1372616 25 15.12 392213 0.462 51612 26 15.47 19865848 23.395 1371458 27 15.83 83260 0.098 7982 28 16.19 100421 0.118 11655 29 16.75 438452 0.516 33942 30 17.2 301313 0.355 22179 31 17.47 439072 0.517 33828 32 17.77 67668 0.08 7859 33 18.11 898818 1.058 43227 34 18.95 619603 0.73 47706 84916607 100 5877050 1 . 0 3 1 . 1 7 1 . 4 1 1 . 4 5 1 . 4 9 1 . 5 9 2 . 2 1 3 . 1 5 3 . 7 9 4 . 1 1 4 . 5 2 5 . 2 7 6 . 7 1 8 . 4 8 9 . 1 2 9 . 8 1 1 0 . 2 3 1 0 . 9 3 1 1 . 7 6 1 2 . 4 9 1 3 . 2 3 1 3 . 5 9 1 4 . 3 2 1 4 . 7 7 1 5 . 1 2 1 5 . 4 7 1 5 . 8 3 1 6 . 1 9 1 6 . 7 5 1 7 . 2 0 1 7 . 4 7 1 7 . 7 7 1 8 . 1 1 1 8 . 9 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 84 Anexo 25: Vanilla pompona inmadura (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.6 0 0 0 2 0.88 13994 0.215 2779 3 1.03 599063 9.224 139414 4 1.2 61539 0.948 14395 5 1.28 123392 1.9 14787 6 1.57 730865 11.254 130581 7 2.27 71354 1.099 5034 8 3.08 352605 5.429 8899 9 3.95 82845 1.276 3133 10 5.31 1478421 22.765 63991 11 6.83 75418 1.161 2432 12 9.41 777848 11.977 22225 13 10.33 227256 3.499 7177 14 10.97 89641 1.38 4892 15 11.39 86144 1.326 4612 16 11.59 72942 1.123 3635 17 12.49 105965 1.632 5689 18 13.27 100770 1.552 5010 19 13.48 45791 0.705 3907 20 13.71 31645 0.487 2377 21 14.25 487055 7.5 43254 22 14.76 389656 6 35936 23 15.09 32827 0.505 3266 24 15.44 86339 1.329 4320 25 15.84 42447 0.654 2342 26 16.2 3120 0.048 469 27 16.49 44746 0.689 5004 28 16.72 41693 0.642 3999 29 17.09 69503 1.07 5324 30 17.49 50331 0.775 4621 31 17.72 19932 0.307 2390 32 17.99 69934 1.077 5830 33 18.29 29262 0.451 1364 34 19.12 0 0 0 6494343 100 563088 0 . 6 0 0 . 8 8 1 . 0 3 1 . 2 0 1 . 2 8 1 . 5 7 2 . 2 7 3 . 0 8 3 . 9 5 5 . 3 1 6 . 8 3 9 . 4 1 1 0 . 3 3 1 0 . 9 7 1 1 . 3 9 1 1 . 5 9 1 2 . 4 9 1 3 . 2 7 1 3 . 4 8 1 3 . 7 1 1 4 . 2 5 1 4 . 7 6 1 5 . 0 9 1 5 . 4 4 1 5 . 8 4 1 6 . 2 0 1 6 . 4 9 1 6 . 7 2 1 7 . 0 9 1 7 . 4 9 1 7 . 7 2 1 7 . 9 9 1 8 . 2 9 1 9 . 1 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 85 Anexo 26: Vanilla pompona inmadura (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.13 10906 0.198 1905 2 1.23 58860 1.069 8832 3 1.56 204355 3.712 20799 4 3.11 301922 5.484 8914 5 3.77 4315 0.078 223 6 5.17 1970060 35.781 100455 7 6.51 15380 0.279 633 8 9.04 255937 4.648 6924 9 10.16 9702 0.176 482 10 11.45 21250 0.386 753 11 12.41 8921 0.162 690 12 13.03 92571 1.681 5619 13 13.52 39101 0.71 2931 14 14.2 1355864 24.626 123315 15 14.71 319222 5.798 26367 16 15.05 94069 1.709 8380 17 15.4 37581 0.683 2942 18 15.79 78007 1.417 4577 19 16.48 136441 2.478 13802 20 16.69 153620 2.79 11955 21 17.11 128292 2.33 6272 22 18.01 143151 2.6 10425 23 18.4 24798 0.45 1360 24 18.93 41586 0.755 2945 5505911 100 371500 Observación: Dado que la señal alrededor de tR = 5 min era muy alta, se diluyó el blanco 10 veces. 1 . 1 3 1 . 2 3 1 . 5 6 3 . 1 1 3 . 7 7 5 . 1 7 6 . 5 1 9 . 0 4 1 0 . 1 6 1 1 . 4 5 1 2 . 4 1 1 3 . 0 3 1 3 . 5 2 1 4 . 2 0 1 4 . 7 1 1 5 . 0 5 1 5 . 4 0 1 5 . 7 9 1 6 . 4 8 1 6 . 6 9 1 7 . 1 1 1 8 . 0 1 1 8 . 4 0 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 86 Anexo 27: Vanilla pompona inmadura (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.01 904843 9.779 300352 2 1.2 67845 0.733 13586 3 1.35 135765 1.467 18074 4 1.49 794970 8.592 207886 5 2.25 108994 1.178 6296 6 3.16 84315 0.911 2794 7 3.43 44896 0.485 2171 8 4.17 129905 1.404 2808 9 5.23 1501547 16.228 78568 10 6.11 77706 0.84 2868 11 6.76 72162 0.78 1837 12 8.57 7217 0.078 377 13 9.19 50956 0.551 1624 14 9.88 51970 0.562 1739 15 10.93 565376 6.11 23947 16 11.71 48919 0.529 2755 17 12.52 154205 1.667 10045 18 13.27 230450 2.491 15088 19 13.77 96554 1.044 5833 20 14.28 283992 3.069 23627 21 14.77 699744 7.563 62847 22 15.47 260794 2.819 20215 23 15.92 48041 0.519 3386 24 16.23 20944 0.226 1957 25 16.77 189677 2.05 17252 26 17.15 18687 0.202 1698 27 17.52 39512 0.427 3544 28 17.79 216301 2.338 20016 29 18.15 2279752 24.639 194788 30 18.64 34639 0.374 3383 31 19 31992 0.346 1729 9252670 100 1053090 1 . 0 1 1 . 2 0 1 . 3 5 1 . 4 9 2 . 2 5 3 . 1 6 3 . 4 3 4 . 1 7 5 . 2 3 6 . 1 1 6 . 7 6 8 . 5 7 9 . 1 9 9 . 8 8 1 0 . 9 3 1 1 . 7 1 1 2 . 5 2 1 3 . 2 7 1 3 . 7 7 1 4 . 2 8 1 4 . 7 7 1 5 . 4 7 1 5 . 9 2 1 6 . 2 3 1 6 . 7 7 1 7 . 1 5 1 7 . 5 2 1 7 . 7 9 1 8 . 1 5 1 8 . 6 4 1 9 . 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 87 Anexo 28: Vanilla pompona inmadura (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.92 34483 0.511 4740 2 1.01 140225 2.079 14217 3 1.21 55214 0.819 19057 4 1.25 232417 3.446 19815 5 1.47 46049 0.683 18466 6 1.6 396280 5.875 23819 7 2.53 51415 0.762 2771 8 3.17 78272 1.16 2579 9 3.83 29509 0.437 835 10 4.52 15673 0.232 764 11 5.29 3239440 48.026 165613 12 6.51 11076 0.164 726 13 6.77 28563 0.423 1372 14 8.51 20078 0.298 805 15 9.15 18101 0.268 590 16 10.53 8674 0.129 446 17 11.05 16245 0.241 838 18 12.01 13320 0.197 412 19 12.52 19180 0.284 1457 20 13.23 31564 0.468 1460 21 13.59 9055 0.134 794 22 14.29 470670 6.978 43023 23 14.79 439397 6.514 39640 24 15.45 500448 7.419 45465 25 15.91 57091 0.846 4260 26 16.23 5852 0.087 494 27 16.75 600156 8.898 50900 28 17.09 2010 0.03 247 29 17.6 19298 0.286 1095 30 17.88 17242 0.256 1338 31 18.2 94409 1.4 4480 32 18.96 43723 0.648 3185 6745129 100 475703 Observación: Dado que la señal alrededor de tR = 5 min era muy alta, se diluyó la muestra 10 veces. 0 . 9 2 1 . 0 1 1 . 2 1 1 . 2 5 1 . 4 7 1 . 6 0 2 . 5 3 3 . 1 7 3 . 8 3 4 . 5 2 5 . 2 9 6 . 5 1 6 . 7 7 8 . 5 1 9 . 1 5 1 0 . 5 3 1 1 . 0 5 1 2 . 0 1 1 2 . 5 2 1 3 . 2 3 1 3 . 5 9 1 4 . 2 9 1 4 . 7 9 1 5 . 4 5 1 5 . 9 1 1 6 . 2 3 1 6 . 7 5 1 7 . 0 9 1 7 . 6 0 1 7 . 8 8 1 8 . 2 0 1 8 . 9 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 88 Anexo 29: Vanilla pompona de prueba (blanco, extracción etanólica), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.16 1800 0.018 100 2 0.97 149690 1.462 27601 3 1.01 122513 1.197 24919 4 1.12 70394 0.688 18050 5 1.19 183175 1.789 21237 6 1.51 1383736 13.516 152054 7 1.61 18320 0.179 2950 8 2.04 9780 0.096 635 9 3.15 86880 0.849 4002 10 3.83 3750 0.037 237 11 4.33 8280 0.081 528 12 5.35 88441 0.864 3372 13 6.04 60172 0.588 1581 14 6.93 17666 0.173 744 15 8.64 62370 0.609 3193 16 9.25 425531 4.156 23200 17 9.44 463942 4.532 23893 18 10.13 221161 2.16 5540 19 10.97 196810 1.922 10772 20 11.61 37365 0.365 2767 21 11.81 21398 0.209 1780 22 12.51 145760 1.424 11108 23 13.24 589058 5.754 46671 24 13.63 75675 0.739 5085 25 14.23 1261379 12.321 113227 26 14.72 3330915 32.535 313955 27 15.43 278311 2.718 24986 28 15.91 9416 0.092 1000 29 16.19 6923 0.068 842 30 16.48 139180 1.359 12079 31 17.15 86772 0.848 5549 32 17.45 268758 2.625 19960 33 17.72 28766 0.281 4098 34 17.97 237624 2.321 13686 35 18.92 146294 1.429 6468 10238005 100 907869 0 . 9 7 1 . 0 1 1 . 1 2 1 . 1 9 1 . 5 1 1 . 6 1 2 . 0 4 3 . 1 5 3 . 8 3 4 . 3 3 5 . 3 5 6 . 0 4 6 . 9 3 8 . 6 4 9 . 2 5 9 . 4 4 1 0 . 1 3 1 0 . 9 7 1 1 . 6 1 1 1 . 8 1 1 2 . 5 1 1 3 . 2 4 1 3 . 6 3 1 4 . 2 3 1 4 . 7 2 1 5 . 4 3 1 5 . 9 1 1 6 . 1 9 1 6 . 4 8 1 7 . 1 5 1 7 . 4 5 1 7 . 7 2 1 7 . 9 7 1 8 . 9 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 89 Anexo 30: Vanilla pompona de prueba (blanco, extracción etanólica), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.97 214052 0.29 46594 2 1.01 248736 0.337 49893 3 1.21 722595 0.98 78662 4 1.43 259939 0.353 40663 5 1.51 739013 1.002 188986 6 1.64 698592 0.948 51065 7 2.08 240131 0.326 16002 8 3.24 1292500 1.753 33367 9 4.29 79573 0.108 4144 10 4.71 76262 0.103 4090 11 5.37 899180 1.22 49799 12 6.31 24936 0.034 911 13 6.92 54493 0.074 1858 14 8.6 1311476 1.779 53688 15 9.21 3466410 4.702 88991 16 10.41 31590 0.043 1586 17 11.01 211984 0.288 10494 18 11.63 116167 0.158 7872 19 11.77 56750 0.077 5661 20 12.52 206387 0.28 17457 21 13.23 1028415 1.395 64637 22 13.61 1799182 2.44 116125 23 14.33 24397326 33.093 1370629 24 14.77 19720936 26.75 1369761 25 15.11 421880 0.572 58825 26 15.43 7857374 10.658 722222 27 15.81 119150 0.162 9201 28 16.48 3254359 4.414 299494 29 17.16 1730937 2.348 73577 30 17.43 83310 0.113 7975 31 17.99 2027133 2.75 169371 32 18.92 332227 0.451 22230 73722995 100 5035830 0 . 9 7 1 . 0 1 1 . 2 1 1 . 4 3 1 . 5 1 1 . 6 4 2 . 0 8 3 . 2 4 4 . 2 9 4 . 7 1 5 . 3 7 6 . 3 1 6 . 9 2 8 . 6 0 9 . 2 1 1 0 . 4 1 1 1 . 0 1 1 1 . 6 3 1 1 . 7 7 1 2 . 5 2 1 3 . 2 3 1 3 . 6 1 1 4 . 3 3 1 4 . 7 7 1 5 . 1 1 1 5 . 4 3 1 5 . 8 1 1 6 . 4 8 1 7 . 1 6 1 7 . 4 3 1 7 . 9 9 1 8 . 9 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 90 Anexo 31: Vanilla pompona de prueba (extracción etanólica y extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.32 1080 0.009 100 2 1.03 682729 5.426 123202 3 1.2 21060 0.167 2392 4 1.51 1296556 10.304 154196 5 2.12 10160 0.081 1465 6 3.15 35610 0.283 1492 7 4.15 50100 0.398 1794 8 5.27 388213 3.085 12234 9 5.88 9970 0.079 468 10 6.81 21760 0.173 660 11 8.52 72039 0.572 3098 12 9.13 556502 4.422 16697 13 10.03 235204 1.869 5517 14 10.92 280273 2.227 14837 15 11.79 28526 0.227 1776 16 12.48 191782 1.524 14050 17 13.23 782330 6.217 53253 18 13.63 43570 0.346 2772 19 14.21 1123824 8.931 97185 20 14.69 3675572 29.209 345869 21 15.39 607377 4.827 47918 22 15.88 9520 0.076 1028 23 16.17 45729 0.363 3104 24 16.48 120543 0.958 6082 25 17.16 87352 0.694 5486 26 17.44 374085 2.973 27700 27 17.75 157703 1.253 14003 28 18.12 1508717 11.99 113979 29 18.95 165702 1.317 10025 12583588 100 1082382 0 . 3 2 1 . 0 3 1 . 2 0 1 . 5 1 2 . 1 2 3 . 1 5 4 . 1 5 5 . 2 7 5 . 8 8 6 . 8 1 8 . 5 2 9 . 1 3 1 0 . 0 3 1 0 . 9 2 1 1 . 7 9 1 2 . 4 8 1 3 . 2 3 1 3 . 6 3 1 4 . 2 1 1 4 . 6 9 1 5 . 3 9 1 5 . 8 8 1 6 . 1 7 1 6 . 4 8 1 7 . 1 6 1 7 . 4 4 1 7 . 7 5 1 8 . 1 2 1 8 . 9 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 In te ns it y (A U) 91 Anexo 32: Vanilla pompona de prueba (extracción etanólica y extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.47 260 0.0003166 100 2 1.03 1095925 1.335 221772 3 1.19 714543 0.87 79622 4 1.51 872472 1.063 137449 5 1.61 504622 0.615 42857 6 2.13 324035 0.395 18072 7 3.15 1218231 1.484 35343 8 4.15 117942 0.144 5210 9 4.52 87130 0.106 4678 10 5.27 4438100 5.405 243795 11 6.75 82410 0.1 2709 12 8.49 1388374 1.691 55161 13 9.12 2508922 3.056 71222 14 9.81 27060 0.033 1897 15 10.41 44709 0.054 2562 16 10.99 252563 0.308 12167 17 11.76 74710 0.091 5134 18 12.49 295403 0.36 23212 19 13.21 1323288 1.612 86024 20 13.59 2206624 2.688 144807 21 14.31 23320244 28.402 1371144 22 14.76 20140916 24.53 1370365 23 15.08 57690 0.07 9472 24 15.41 16912371 20.598 1369242 25 15.8 195140 0.238 18225 26 16.16 76216 0.093 9992 27 16.48 394173 0.48 42749 28 16.72 403950 0.492 37385 29 17.19 699835 0.852 46114 30 17.41 541365 0.659 41414 31 17.76 36941 0.045 5039 32 18.01 827644 1.008 51409 33 18.37 143220 0.174 11280 34 18.93 779852 0.95 63359 82106880 100 5640982 0 . 4 7 1 . 0 3 1 . 1 9 1 . 5 1 1 . 6 1 2 . 1 3 3 . 1 5 4 . 1 5 4 . 5 2 5 . 2 7 6 . 7 5 8 . 4 9 9 . 1 2 9 . 8 1 1 0 . 4 1 1 0 . 9 9 1 1 . 7 6 1 2 . 4 9 1 3 . 2 1 1 3 . 5 9 1 4 . 3 1 1 4 . 7 6 1 5 . 0 8 1 5 . 4 1 1 5 . 8 0 1 6 . 1 6 1 6 . 4 8 1 6 . 7 2 1 7 . 1 9 1 7 . 4 1 1 7 . 7 6 1 8 . 0 1 1 8 . 3 7 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 92 Anexo 33: Vanilla pompona de prueba (blanco, extracción Soxhlet 7 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 154031 1.383 24524 2 1.23 58716 0.527 14464 3 1.28 92798 0.833 20354 4 1.37 99134 0.89 14162 5 1.53 61776 0.555 16781 6 1.59 1544802 13.873 138821 7 1.75 26090 0.234 3876 8 2.48 12560 0.113 1268 9 2.97 12645 0.114 1259 10 3.23 48054 0.432 3246 11 4.04 52300 0.47 2824 12 4.51 9729 0.087 536 13 5.44 59744 0.537 2750 14 6.32 63465 0.57 1537 15 6.89 26120 0.235 1262 16 8.67 54097 0.486 2759 17 9.45 1148302 10.312 36304 18 10.41 70839 0.636 2482 19 10.99 181834 1.633 11159 20 11.6 53322 0.479 3822 21 11.83 18125 0.163 1684 22 12.53 179937 1.616 12410 23 13.27 629640 5.654 53078 24 13.64 90192 0.81 5257 25 14.24 1320599 11.859 117232 26 14.72 3758349 33.751 354177 27 15.12 41679 0.374 5310 28 15.44 273493 2.456 25582 29 15.95 39064 0.351 4174 30 16.15 47870 0.43 4123 31 16.52 131802 1.184 11903 32 17.21 73729 0.662 5352 33 17.45 343718 3.087 26766 34 17.73 36168 0.325 4120 35 18.01 195004 1.751 11749 36 18.69 38487 0.346 2226 37 18.96 87184 0.783 5733 11135398 100 955066 1 . 0 4 1 . 2 3 1 . 2 8 1 . 3 7 1 . 5 3 1 . 5 9 1 . 7 5 2 . 4 8 2 . 9 7 3 . 2 3 4 . 0 4 4 . 5 1 5 . 4 4 6 . 3 2 6 . 8 9 8 . 6 7 9 . 4 5 1 0 . 4 1 1 0 . 9 9 1 1 . 6 0 1 1 . 8 3 1 2 . 5 3 1 3 . 2 7 1 3 . 6 4 1 4 . 2 4 1 4 . 7 2 1 5 . 1 2 1 5 . 4 4 1 5 . 9 5 1 6 . 1 5 1 6 . 5 2 1 7 . 2 1 1 7 . 4 5 1 7 . 7 3 1 8 . 0 1 1 8 . 6 9 1 8 . 9 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 93 Anexo 34: Vanilla pompona de prueba (blanco, extracción Soxhlet 7 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.69 0 0 0 2 0.93 8573 0.011 4480 3 1.04 287414 0.377 42410 4 1.31 644778 0.847 76373 5 1.48 158964 0.209 32162 6 1.59 801819 1.053 188243 7 1.76 1085882 1.426 57007 8 2.43 279473 0.367 16552 9 2.97 489054 0.642 25409 10 3.31 549122 0.721 23706 11 4.01 287929 0.378 7897 12 4.75 95847 0.126 5001 13 5.44 769691 1.011 46772 14 6.61 59643 0.078 2346 15 6.93 65075 0.085 2514 16 8.65 1001600 1.315 46234 17 9.29 3887135 5.104 117410 18 10.56 135518 0.178 5352 19 11 173084 0.227 8521 20 11.61 143593 0.189 10451 21 11.8 52908 0.069 5522 22 12.53 246767 0.324 19453 23 13.25 997852 1.31 76609 24 13.63 1772686 2.328 121592 25 14.35 24581059 32.275 1372073 26 14.8 20979777 27.546 1370990 27 15.12 431960 0.567 61077 28 15.44 8488695 11.146 785611 29 15.93 453650 0.596 39475 30 16.51 2885827 3.789 284564 31 16.75 66720 0.088 9636 32 17.21 1324152 1.739 79801 33 17.43 513299 0.674 47392 34 18.03 1826373 2.398 158134 35 18.96 615419 0.808 51355 76161338 100 5202124 0 . 6 9 0 . 9 3 1 . 0 4 1 . 3 1 1 . 4 8 1 . 5 9 1 . 7 6 2 . 4 3 2 . 9 7 3 . 3 1 4 . 0 1 4 . 7 5 5 . 4 4 6 . 6 1 6 . 9 3 8 . 6 5 9 . 2 9 1 0 . 5 6 1 1 . 0 0 1 1 . 6 1 1 1 . 8 0 1 2 . 5 3 1 3 . 2 5 1 3 . 6 3 1 4 . 3 5 1 4 . 8 0 1 5 . 1 2 1 5 . 4 4 1 5 . 9 3 1 6 . 5 1 1 6 . 7 5 1 7 . 2 1 1 7 . 4 3 1 8 . 0 3 1 8 . 9 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 94 Anexo 35: Vanilla pompona de prueba (extracción Soxhlet 7 horas y extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.81 2580 0.021 129 2 1.01 468433 3.771 81188 3 1.28 1610 0.013 590 4 1.47 1349061 10.861 181244 5 2.36 23760 0.191 987 6 3.91 50164 0.404 1961 7 4.21 23275 0.187 1439 8 5.25 457722 3.685 15048 9 6.35 12764 0.103 516 10 6.75 19935 0.16 567 11 8.49 61440 0.495 2209 12 9.11 246345 1.983 9842 13 10.05 71226 0.573 2324 14 10.91 234851 1.891 12420 15 11.76 20414 0.164 1460 16 12.48 181365 1.46 13556 17 13.23 684015 5.507 53122 18 13.75 112580 0.906 6130 19 14.24 717589 5.777 59013 20 14.69 3943254 31.745 380159 21 15.4 827788 6.664 74415 22 15.93 76565 0.616 5831 23 16.49 60191 0.485 4680 24 17.15 22704 0.183 1833 25 17.43 405420 3.264 36720 26 17.75 229345 1.846 19733 27 18.12 1947486 15.678 165299 28 18.56 27728 0.223 2893 29 18.95 141998 1.143 10110 12421608 100 1145418 0 . 8 1 1 . 0 1 1 . 2 8 1 . 4 7 2 . 3 6 3 . 9 1 4 . 2 1 5 . 2 5 6 . 3 5 6 . 7 5 8 . 4 9 9 . 1 1 1 0 . 0 5 1 0 . 9 1 1 1 . 7 6 1 2 . 4 8 1 3 . 2 3 1 3 . 7 5 1 4 . 2 4 1 4 . 6 9 1 5 . 4 0 1 5 . 9 3 1 6 . 4 9 1 7 . 1 5 1 7 . 4 3 1 7 . 7 5 1 8 . 1 2 1 8 . 5 6 1 8 . 9 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 95 Anexo 36: Vanilla pompona de prueba (extracción Soxhlet 7 horas y extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.01 375562 0.462 144562 2 1.08 270110 0.332 72144 3 1.17 601908 0.74 71955 4 1.47 1484778 1.826 194537 5 2.33 288762 0.355 12284 6 2.87 335029 0.412 16119 7 3.15 336129 0.413 17600 8 3.89 158562 0.195 3984 9 4.53 42663 0.052 2605 10 5.25 6377460 7.843 302252 11 6.72 59120 0.073 2346 12 8.49 1102858 1.356 38363 13 9.09 1134544 1.395 48907 14 9.81 126709 0.156 4755 15 10.49 88375 0.109 4368 16 10.93 134150 0.165 6399 17 11.75 69430 0.085 4681 18 12.48 291941 0.359 21971 19 13.23 716872 0.882 54311 20 13.6 1074297 1.321 62719 21 14.31 20427785 25.121 1374831 22 14.77 20214273 24.859 1373997 23 15.47 21240260 26.12 1372758 24 15.93 333570 0.41 37503 25 16.37 2480 0.003 515 26 16.73 490960 0.604 30744 27 17.17 123551 0.152 9708 28 17.43 730186 0.898 59880 29 17.73 106599 0.131 10432 30 18.12 614246 0.755 38866 31 18.93 1963900 2.415 162762 81317069 100 5558858 1 . 0 1 1 . 0 8 1 . 1 7 1 . 4 7 2 . 3 3 2 . 8 7 3 . 1 5 3 . 8 9 4 . 5 3 5 . 2 5 6 . 7 2 8 . 4 9 9 . 0 9 9 . 8 1 1 0 . 4 9 1 0 . 9 3 1 1 . 7 5 1 2 . 4 8 1 3 . 2 3 1 3 . 6 0 1 4 . 3 1 1 4 . 7 7 1 5 . 4 7 1 5 . 9 3 1 6 . 3 7 1 6 . 7 3 1 7 . 1 7 1 7 . 4 3 1 7 . 7 3 1 8 . 1 2 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 96 Anexo 37: Vanilla pompona madura (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.08 303759 2.222 53793 2 1.24 69902 0.511 17046 3 1.31 155802 1.14 17112 4 1.61 875203 6.402 133196 5 2.33 7440 0.054 953 6 3.13 89272 0.653 3838 7 3.76 6489 0.047 401 8 4.24 6878 0.05 381 9 5.4 381621 2.792 13614 10 6.95 6610 0.048 197 11 8.64 50586 0.37 2281 12 9.27 500194 3.659 15527 13 10.01 175965 1.287 4559 14 11.01 227921 1.667 12059 15 11.63 41391 0.303 1760 16 12.55 276275 2.021 20225 17 13.28 583609 4.269 42401 18 13.85 128745 0.942 10048 19 14.28 624348 4.567 54625 20 14.71 6394883 46.781 556527 21 15.12 127838 0.935 16395 22 15.45 911704 6.669 61711 23 15.93 20624 0.151 2048 24 16.13 43286 0.317 3028 25 16.73 130524 0.955 8053 26 17.15 110929 0.811 8473 27 17.51 595212 4.354 52901 28 17.99 395040 2.89 24290 29 18.59 84129 0.615 5713 30 18.97 343564 2.513 18675 13669743 100 1161830 1 . 0 8 1 . 2 4 1 . 3 1 1 . 6 1 2 . 3 3 3 . 1 3 3 . 7 6 4 . 2 4 5 . 4 0 6 . 9 5 8 . 6 4 9 . 2 7 1 0 . 0 1 1 1 . 0 1 1 1 . 6 3 1 2 . 5 5 1 3 . 2 8 1 3 . 8 5 1 4 . 2 8 1 4 . 7 1 1 5 . 1 2 1 5 . 4 5 1 5 . 9 3 1 6 . 1 3 1 6 . 7 3 1 7 . 1 5 1 7 . 5 1 1 7 . 9 9 1 8 . 5 9 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 97 Anexo 38: Vanilla pompona madura (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.08 372860 0.442 91137 2 1.13 213880 0.253 55237 3 1.29 340755 0.404 66612 4 1.35 389980 0.462 70062 5 1.61 1039560 1.232 155212 6 2.33 128500 0.152 7637 7 3.27 1506185 1.785 56237 8 3.88 69055 0.082 3887 9 4.23 86665 0.103 3837 10 4.61 13100 0.016 1200 11 5.4 5218760 6.185 270322 12 6.89 82560 0.098 2775 13 8.61 985732 1.168 38319 14 9.24 2273048 2.694 66487 15 9.88 19260 0.023 1582 16 10.55 61410 0.073 3955 17 11.03 199999 0.237 9333 18 11.65 67422 0.08 5301 19 11.8 78946 0.094 5759 20 12.55 431542 0.511 32545 21 13.28 559918 0.664 40478 22 13.61 994320 1.178 55090 23 14.32 18519088 21.948 1372805 24 14.83 25948252 30.753 1371723 25 15.13 130520 0.155 23112 26 15.48 17524016 20.769 1370326 27 15.93 135520 0.161 15132 28 16.75 2703332 3.204 202844 29 17.16 349549 0.414 25561 30 17.51 1916971 2.272 164695 31 17.99 1146685 1.359 61070 32 18.31 22700 0.027 1803 33 18.97 847011 1.004 43261 84377101 100 5695336 1 . 0 8 1 . 1 3 1 . 2 9 1 . 3 5 1 . 6 1 2 . 3 3 3 . 2 7 3 . 8 8 4 . 2 3 4 . 6 1 5 . 4 0 6 . 8 9 8 . 6 1 9 . 2 4 9 . 8 8 1 0 . 5 5 1 1 . 0 3 1 1 . 6 5 1 1 . 8 0 1 2 . 5 5 1 3 . 2 8 1 3 . 6 1 1 4 . 3 2 1 4 . 8 3 1 5 . 1 3 1 5 . 4 8 1 5 . 9 3 1 6 . 7 5 1 7 . 1 6 1 7 . 5 1 1 7 . 9 9 1 8 . 3 1 1 8 . 9 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 98 Anexo 39: Vanilla pompona madura (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 549564 3.338 142300 2 1.24 88595 0.538 14970 3 1.33 42969 0.261 11406 4 1.52 962600 5.846 140778 5 2.35 13100 0.08 1563 6 3.17 63130 0.383 2654 7 4.08 44149 0.268 1192 8 5.31 414150 2.515 15958 9 6.95 4077 0.025 357 10 7.32 30262 0.184 994 11 8.56 50671 0.308 2179 12 9.19 324210 1.969 11584 13 9.85 186835 1.135 5702 14 10.96 297242 1.805 13732 15 11.79 19260 0.117 1259 16 12.52 283726 1.723 21034 17 13.27 638530 3.878 47960 18 13.83 228982 1.391 16179 19 14.27 511351 3.106 45414 20 14.69 6864653 41.692 585864 21 15.44 922257 5.601 66315 22 15.92 31164 0.189 2828 23 16.2 41652 0.253 3150 24 16.76 248812 1.511 18260 25 17.05 61264 0.372 6971 26 17.15 72858 0.442 6907 27 17.51 377945 2.295 31643 28 17.77 191702 1.164 18819 29 18.15 2344625 14.24 160835 30 18.57 71058 0.432 6721 31 18.99 483836 2.939 30203 16465229 100 1435731 1 . 0 4 1 . 2 4 1 . 3 3 1 . 5 2 2 . 3 5 3 . 1 7 4 . 0 8 5 . 3 1 6 . 9 5 7 . 3 2 8 . 5 6 9 . 1 9 9 . 8 5 1 0 . 9 6 1 1 . 7 9 1 2 . 5 2 1 3 . 2 7 1 3 . 8 3 1 4 . 2 7 1 4 . 6 9 1 5 . 4 4 1 5 . 9 2 1 6 . 2 0 1 6 . 7 6 1 7 . 0 5 1 7 . 1 5 1 7 . 5 1 1 7 . 7 7 1 8 . 1 5 1 8 . 5 7 1 8 . 9 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 99 Anexo 40: Vanilla pompona madura (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 1239118 1.431 276107 2 1.21 481167 0.555 76896 3 1.51 1211129 1.398 159247 4 2.35 147710 0.171 7778 5 3.16 1204870 1.391 48496 6 4.15 217466 0.251 5553 7 4.53 71797 0.083 4051 8 5.31 6107540 7.051 335220 9 6.76 135012 0.156 3930 10 7.41 22107 0.026 681 11 8.55 1040589 1.201 42498 12 9.17 1610989 1.86 53757 13 9.84 33350 0.039 2731 14 10.53 196204 0.227 9519 15 11.03 217067 0.251 9477 16 11.79 116897 0.135 6957 17 12.52 471001 0.544 34377 18 13.27 650078 0.75 48519 19 13.59 1068999 1.234 50101 20 13.83 46900 0.054 6337 21 14.27 13181489 15.217 1208707 22 14.81 26038616 30.06 1371391 23 15.48 20281854 23.415 1370000 24 15.93 354640 0.409 40400 25 16.2 24570 0.028 3444 26 16.76 6580671 7.597 558704 27 17.16 44040 0.051 5775 28 17.51 1119380 1.292 88396 29 18.01 1550599 1.79 70888 30 18.99 1155042 1.333 66132 86620891 100 5966069 1 . 0 4 1 . 2 1 1 . 5 1 2 . 3 5 3 . 1 6 4 . 1 5 4 . 5 3 5 . 3 1 6 . 7 6 7 . 4 1 8 . 5 5 9 . 1 7 9 . 8 4 1 0 . 5 3 1 1 . 0 3 1 1 . 7 9 1 2 . 5 2 1 3 . 2 7 1 3 . 5 9 1 3 . 8 3 1 4 . 2 7 1 4 . 8 1 1 5 . 4 8 1 5 . 9 3 1 6 . 2 0 1 6 . 7 6 1 7 . 1 6 1 7 . 5 1 1 8 . 0 1 1 8 . 9 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 100 Anexo 41: Vanilla pompona madura (blanco, extracción Soxhlet 24 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.24 3140 0.102 151 2 0.92 4326 0.141 813 3 1.04 17145 0.559 2031 4 1.25 20597 0.672 3020 5 1.45 9894 0.323 2059 6 1.51 41251 1.345 15731 7 1.61 206523 6.736 6876 8 2.52 12850 0.419 597 9 3.16 7560 0.247 538 10 5.33 54385 1.774 1227 11 6.2 12066 0.394 356 12 6.68 888 0.029 180 13 7.03 560 0.018 87 14 9.45 567570 18.511 15632 15 11.05 41445 1.352 2209 16 11.64 17963 0.586 782 17 12.55 63265 2.063 4670 18 13.35 117956 3.847 8552 19 13.89 22881 0.746 1672 20 14.32 174569 5.694 15684 21 14.8 1360645 44.377 121689 22 15.49 105747 3.449 9012 23 16.17 26129 0.852 1337 24 16.52 33391 1.089 1761 25 17.17 8439 0.275 665 26 17.49 42625 1.39 2768 27 18.19 36733 1.198 1642 28 18.64 12583 0.41 950 29 18.99 42980 1.402 2999 3066106 100 225690 0 . 2 4 0 . 9 2 1 . 0 4 1 . 2 5 1 . 4 5 1 . 5 1 1 . 6 1 2 . 5 2 3 . 1 6 5 . 3 3 6 . 2 0 6 . 6 8 7 . 0 3 9 . 4 5 1 1 . 0 5 1 1 . 6 4 1 2 . 5 5 1 3 . 3 5 1 3 . 8 9 1 4 . 3 2 1 4 . 8 0 1 5 . 4 9 1 6 . 1 7 1 6 . 5 2 1 7 . 1 7 1 7 . 4 9 1 8 . 1 9 1 8 . 6 4 1 8 . 9 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 101 Anexo 42: Vanilla pompona madura (blanco, extracción Soxhlet 24 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.87 8370 0.039 1454 2 1.03 36114 0.169 8169 3 1.16 24650 0.115 5115 4 1.28 86963 0.407 13664 5 1.43 11497 0.054 3058 6 1.49 18088 0.085 14168 7 1.61 208686 0.976 13992 8 2.44 37722 0.176 3089 9 2.56 47756 0.223 3188 10 3.25 111623 0.522 3513 11 3.84 24378 0.114 661 12 4.77 5253 0.025 359 13 5.41 308100 1.442 16305 14 6.71 46740 0.219 778 15 9.44 1747394 8.176 45953 16 10.55 25593 0.12 1096 17 11.07 24854 0.116 1183 18 11.65 42457 0.199 1764 19 12.56 94780 0.443 7348 20 13.35 103638 0.485 8356 21 13.64 166266 0.778 10228 22 14.32 4544866 21.264 418141 23 14.8 9200347 43.046 828453 24 15.49 2878513 13.468 246126 25 15.97 134740 0.63 11891 26 16.51 395705 1.851 27866 27 17.16 43659 0.204 3984 28 17.48 94920 0.444 5775 29 18.04 215202 1.007 16148 30 18.97 630908 2.952 54489 31 19.33 53461 0.25 5924 21373243 100 1782238 0 . 8 7 1 . 0 3 1 . 1 6 1 . 2 8 1 . 4 3 1 . 4 9 1 . 6 1 2 . 4 4 2 . 5 6 3 . 2 5 3 . 8 4 4 . 7 7 5 . 4 1 6 . 7 1 9 . 4 4 1 0 . 5 5 1 1 . 0 7 1 1 . 6 5 1 2 . 5 6 1 3 . 3 5 1 3 . 6 4 1 4 . 3 2 1 4 . 8 0 1 5 . 4 9 1 5 . 9 7 1 6 . 5 1 1 7 . 1 6 1 7 . 4 8 1 8 . 0 4 1 8 . 9 7 1 9 . 3 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 102 Anexo 43: Vanilla pompona madura (extracción Soxhlet 24 horas y extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 82424 1.519 15798 2 1.23 43985 0.811 5218 3 1.49 356770 6.574 44136 4 1.59 11640 0.214 1221 5 2.57 62203 1.146 2539 6 3.44 8556 0.158 640 7 4.15 81 0.002 101 8 4.41 10523 0.194 571 9 5.2 47799 0.881 2106 10 6.35 6571 0.121 219 11 7.04 11905 0.219 322 12 8.41 3059 0.056 208 13 9.04 63900 1.177 2241 14 10.92 72480 1.336 3425 15 11.67 2000 0.037 161 16 12.45 67514 1.244 5053 17 13.24 143179 2.638 9965 18 13.76 89001 1.64 5131 19 14.25 77919 1.436 6750 20 14.73 1638671 30.196 146671 21 15.43 224867 4.144 19068 22 15.92 7443 0.137 787 23 16.23 8809 0.162 753 24 16.63 18088 0.333 1483 25 17.12 9836 0.181 552 26 17.44 67980 1.253 6416 27 17.75 213721 3.938 18607 28 18.12 2038543 37.564 166015 29 18.93 37350 0.688 3031 5426817 100 469188 1 . 0 4 1 . 2 3 1 . 4 9 1 . 5 9 2 . 5 7 3 . 4 4 4 . 1 5 4 . 4 1 5 . 2 0 6 . 3 5 7 . 0 4 8 . 4 1 9 . 0 4 1 0 . 9 2 1 1 . 6 7 1 2 . 4 5 1 3 . 2 4 1 3 . 7 6 1 4 . 2 5 1 4 . 7 3 1 5 . 4 3 1 5 . 9 2 1 6 . 2 3 1 6 . 6 3 1 7 . 1 2 1 7 . 4 4 1 7 . 7 5 1 8 . 1 2 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 103 Anexo 44: Vanilla pompona madura (extracción Soxhlet 24 horas y extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.79 0 0 0 2 1.04 105234 0.456 33876 3 1.11 97957 0.424 18280 4 1.24 96333 0.417 17337 5 1.37 46698 0.202 7145 6 1.49 52432 0.227 26731 7 1.61 178095 0.771 10593 8 2.41 211878 0.918 8213 9 3.07 206381 0.894 5880 10 3.89 8845 0.038 741 11 4.39 8211 0.036 459 12 5.19 911120 3.946 44896 13 6.32 19710 0.085 482 14 8.37 146445 0.634 5095 15 9.04 255974 1.109 10471 16 10.45 26712 0.116 1559 17 11 24697 0.107 1279 18 11.71 15410 0.067 1005 19 12.45 103497 0.448 7950 20 13.25 155686 0.674 9250 21 13.81 87875 0.381 4593 22 14.27 1379480 5.975 118858 23 14.73 10906682 47.241 988160 24 15.43 6287933 27.235 549107 25 15.93 107110 0.464 11491 26 16.19 2220 0.01 300 27 16.63 178783 0.774 10221 28 17.16 23921 0.104 2088 29 17.44 129992 0.563 11034 30 17.75 66886 0.29 5356 31 18.12 456973 1.979 35043 32 18.93 788194 3.414 62457 23087364 100 2009950 0 . 7 9 1 . 0 4 1 . 1 1 1 . 2 4 1 . 3 7 1 . 4 9 1 . 6 1 2 . 4 1 3 . 0 7 3 . 8 9 4 . 3 9 5 . 1 9 6 . 3 2 8 . 3 7 9 . 0 4 1 0 . 4 5 1 1 . 0 0 1 1 . 7 1 1 2 . 4 5 1 3 . 2 5 1 3 . 8 1 1 4 . 2 7 1 4 . 7 3 1 5 . 4 3 1 5 . 9 3 1 6 . 1 9 1 6 . 6 3 1 7 . 1 6 1 7 . 4 4 1 7 . 7 5 1 8 . 1 2 1 8 . 9 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 In te ns it y (A U) 104 Anexo 45: Vanilla planifolia curada de marzo del 2006 (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1 929192 8.577 172473 2 1.16 30060 0.277 10660 3 1.28 24270 0.224 3305 4 1.45 56346 0.52 22944 5 1.51 764815 7.059 124188 6 2.24 6480 0.06 532 7 3.32 366612 3.384 8273 8 3.97 96882 0.894 4620 9 4.33 72867 0.673 3202 10 5.4 118838 1.097 6051 11 5.91 594827 5.49 16316 12 6.93 123400 1.139 3819 13 9.27 449646 4.15 7842 14 10.96 600291 5.541 33693 15 11.67 12002 0.111 570 16 12.56 559603 5.165 44853 17 13.27 1477341 13.636 103805 18 14.77 4155898 38.36 387794 19 15.51 13967 0.129 1184 20 15.89 22834 0.211 1196 21 16.64 21678 0.2 1206 22 17.04 53442 0.493 3107 23 17.47 198467 1.832 15360 24 18.04 14106 0.13 1382 25 18.25 28125 0.26 2109 26 18.64 27557 0.254 1832 27 19.05 14401 0.133 834 10833947 100 983150 1 . 0 0 1 . 1 6 1 . 2 8 1 . 4 5 1 . 5 1 2 . 2 4 3 . 3 2 3 . 9 7 4 . 3 3 5 . 4 0 5 . 9 1 6 . 9 3 9 . 2 7 1 0 . 9 6 1 1 . 6 7 1 2 . 5 6 1 3 . 2 7 1 4 . 7 7 1 5 . 5 1 1 5 . 8 9 1 6 . 6 4 1 7 . 0 4 1 7 . 4 7 1 8 . 0 4 1 8 . 2 5 1 8 . 6 4 1 9 . 0 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 105 Anexo 46: Vanilla planifolia curada de marzo del 2006 (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1 1123821 3.36 281841 2 1.16 186637 0.558 52939 3 1.24 394230 1.179 55812 4 1.36 372336 1.113 48323 5 1.52 2022421 6.047 222370 6 2.81 379179 1.134 17275 7 3.09 288936 0.864 10333 8 3.93 113970 0.341 4205 9 4.65 124483 0.372 4867 10 5.37 489943 1.465 28827 11 5.91 150995 0.451 5604 12 6.92 34131 0.102 1803 13 8.64 306798 0.917 11466 14 9.25 1141481 3.413 27853 15 10.99 241680 0.723 12189 16 11.84 91075 0.272 4929 17 12.56 962969 2.879 75438 18 13.28 1660849 4.966 98921 19 14.01 50920 0.152 3970 20 14.36 86556 0.259 4734 21 14.85 22018672 65.834 1378813 22 15.51 104915 0.314 11205 23 15.88 378954 1.133 27115 24 16.21 21222 0.063 2661 25 16.37 31383 0.094 2689 26 16.64 24113 0.072 1912 27 17.13 175159 0.524 14213 28 17.47 308318 0.922 24619 29 18.07 83759 0.25 3774 30 18.59 40826 0.122 2487 31 19.03 34856 0.104 2083 33445587 100 2445270 1 . 0 0 1 . 1 6 1 . 2 4 1 . 3 6 1 . 5 2 2 . 8 1 3 . 0 9 3 . 9 3 4 . 6 5 5 . 3 7 5 . 9 1 6 . 9 2 8 . 6 4 9 . 2 5 1 0 . 9 9 1 1 . 8 4 1 2 . 5 6 1 3 . 2 8 1 4 . 0 1 1 4 . 3 6 1 4 . 8 5 1 5 . 5 1 1 5 . 8 8 1 6 . 2 1 1 6 . 3 7 1 6 . 6 4 1 7 . 1 3 1 7 . 4 7 1 8 . 0 7 1 8 . 5 9 1 9 . 0 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 106 Anexo 47: Vanilla planifolia curada de marzo del 2006 (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 1229409 8.643 293639 2 1.45 263894 1.855 41212 3 1.51 1227096 8.627 162881 4 2.28 9740 0.068 919 5 3.21 8830 0.062 498 6 3.95 49371 0.347 1618 7 4.28 44929 0.316 1341 8 5.33 188972 1.329 8980 9 5.84 88407 0.622 3017 10 6.36 26826 0.189 1259 11 6.87 21962 0.154 771 12 8.6 40702 0.286 1783 13 9.2 108677 0.764 3842 14 10.92 949751 6.677 54986 15 12.2 84860 0.597 6516 16 12.52 618940 4.351 50393 17 13.24 2120384 14.907 155846 18 13.77 60809 0.428 4390 19 14.29 26304 0.185 2793 20 14.73 4654665 32.723 434170 21 15.45 22077 0.155 1223 22 15.93 2364 0.017 335 23 16.41 5465 0.038 471 24 16.61 11763 0.083 1009 25 17.13 24952 0.175 2013 26 17.45 201245 1.415 18504 27 17.77 219572 1.544 18595 28 18.16 1894350 13.318 156024 29 19 17717 0.125 1119 30 19.47 200 0.001 75 14224233 100 1430222 1 . 0 4 1 . 4 5 1 . 5 1 2 . 2 8 3 . 2 1 3 . 9 5 4 . 2 8 5 . 3 3 5 . 8 4 6 . 3 6 6 . 8 7 8 . 6 0 9 . 2 0 1 0 . 9 2 1 2 . 2 0 1 2 . 5 2 1 3 . 2 4 1 3 . 7 7 1 4 . 2 9 1 4 . 7 3 1 5 . 4 5 1 5 . 9 3 1 6 . 4 1 1 6 . 6 1 1 7 . 1 3 1 7 . 4 5 1 7 . 7 7 1 8 . 1 6 1 9 . 0 0 1 9 . 4 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 107 Anexo 48: Vanilla planifolia curada de marzo del 2006 (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 1.04 1889031 5.245 522602 2 1.16 664339 1.844 94420 3 1.51 1518343 4.215 201040 4 2.28 137192 0.381 6426 5 3.19 234524 0.651 6736 6 3.45 60124 0.167 4261 7 3.92 100744 0.28 3449 8 4.6 116721 0.324 3982 9 5.33 3225136 8.954 176801 10 6.35 14743 0.041 839 11 6.83 15820 0.044 928 12 8.57 777763 2.159 32938 13 9.2 449851 1.249 18447 14 10.93 218164 0.606 11554 15 11.81 68554 0.19 5053 16 12.21 193476 0.537 14959 17 12.52 1030767 2.862 82791 18 13.24 1909869 5.302 135233 19 13.83 3260 0.009 438 20 14.32 18008 0.05 1971 21 14.83 22009216 61.104 1374406 22 15.47 145750 0.405 14525 23 15.87 16290 0.045 1254 24 16.4 68027 0.189 4550 25 16.64 89129 0.247 6089 26 17.17 78037 0.217 3906 27 17.44 378696 1.051 30677 28 17.76 80896 0.225 6863 29 18.16 441675 1.226 33869 30 18.53 23349 0.065 1869 31 19 41696 0.116 2768 36019190 100 2805644 1 . 0 4 1 . 1 6 1 . 5 1 2 . 2 8 3 . 1 9 3 . 4 5 3 . 9 2 4 . 6 0 5 . 3 3 6 . 3 5 6 . 8 3 8 . 5 7 9 . 2 0 1 0 . 9 3 1 1 . 8 1 1 2 . 2 1 1 2 . 5 2 1 3 . 2 4 1 3 . 8 3 1 4 . 3 2 1 4 . 8 3 1 5 . 4 7 1 5 . 8 7 1 6 . 4 0 1 6 . 6 4 1 7 . 1 7 1 7 . 4 4 1 7 . 7 6 1 8 . 1 6 1 8 . 5 3 1 9 . 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 108 Anexo 49: Vanilla planifolia curada de setiembre del 2007 (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1 790331 9.636 150722 2 1.12 55900 0.682 12258 3 1.29 38340 0.467 6437 4 1.51 1112748 13.567 95656 5 2.33 17160 0.209 1157 6 2.77 3119 0.038 280 7 3.91 139712 1.703 3319 8 5.28 42868 0.523 1600 9 6.36 38140 0.465 1019 10 9.15 187780 2.289 4957 11 10.95 479033 5.84 29391 12 12.52 718125 8.755 52625 13 13.25 1024280 12.488 82021 14 13.83 8041 0.098 466 15 14.73 3251914 39.647 299843 16 15.47 41528 0.506 2164 17 16.6 33022 0.403 1275 18 17.04 48127 0.587 2833 19 17.44 108554 1.323 6148 20 18.2 22651 0.276 1589 21 18.59 30049 0.366 2157 22 19.04 10655 0.13 712 8202077 100 758629 1 . 0 0 1 . 1 2 1 . 2 9 1 . 5 1 2 . 3 3 2 . 7 7 3 . 9 1 5 . 2 8 6 . 3 6 9 . 1 5 1 0 . 9 5 1 2 . 5 2 1 3 . 2 5 1 3 . 8 3 1 4 . 7 3 1 5 . 4 7 1 6 . 6 0 1 7 . 0 4 1 7 . 4 4 1 8 . 2 0 1 8 . 5 9 1 9 . 0 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 109 Anexo 50: Vanilla planifolia curada de setiembre del 2007 (blanco, extracción en medio acuoso: sin enzimas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 1 923022 3.373 246434 2 1.11 236809 0.865 46558 3 1.25 321212 1.174 47144 4 1.39 293319 1.072 43467 5 1.51 1026497 3.751 143528 6 2.21 214090 0.782 7907 7 2.79 123650 0.452 7087 8 3.01 99145 0.362 4972 9 3.92 197476 0.722 4186 10 5.32 366064 1.338 20599 11 6.35 18685 0.068 918 12 6.83 18450 0.067 1130 13 7.65 6080 0.022 350 14 8.6 86607 0.316 3841 15 9.16 591703 2.162 23475 16 9.84 46659 0.17 2535 17 10.96 228750 0.836 11765 18 11.79 113494 0.415 7619 19 12.52 1146273 4.189 86319 20 13.25 955189 3.49 73144 21 14.31 63542 0.232 2324 22 14.8 19500460 71.257 1377895 23 15.47 399110 1.458 38668 24 15.83 44809 0.164 4158 25 16.16 10635 0.039 1229 26 16.39 19060 0.07 1737 27 16.63 24636 0.09 2171 28 17.08 44080 0.161 3012 29 17.44 148236 0.542 8850 30 18.19 26192 0.096 1627 31 18.55 33544 0.123 2040 32 19.03 38853 0.142 1583 27366331 100 2228272 1 . 0 0 1 . 1 1 1 . 2 5 1 . 3 9 1 . 5 1 2 . 2 1 2 . 7 9 3 . 0 1 3 . 9 2 5 . 3 2 6 . 3 5 6 . 8 3 7 . 6 5 8 . 6 0 9 . 1 6 9 . 8 4 1 0 . 9 6 1 1 . 7 9 1 2 . 5 2 1 3 . 2 5 1 4 . 3 1 1 4 . 8 0 1 5 . 4 7 1 5 . 8 3 1 6 . 1 6 1 6 . 3 9 1 6 . 6 3 1 7 . 0 8 1 7 . 4 4 1 8 . 1 9 1 8 . 5 5 1 9 . 0 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 110 Anexo 51: Vanilla planifolia curada de setiembre del 2007 (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 254 nm No. RT Area Area % Height 1 0.05 1000 0.009 125 2 0.69 718 0.006 196 3 1.04 1204160 10.696 278263 4 1.23 10700 0.095 3214 5 1.45 82938 0.737 19273 6 1.51 984962 8.749 109968 7 2.27 9440 0.084 675 8 3.93 143600 1.276 4205 9 5.32 60493 0.537 3345 10 6.37 48126 0.427 1363 11 8.61 4032 0.036 234 12 9.2 100507 0.893 4471 13 10.95 552930 4.912 34516 14 12.17 51915 0.461 2740 15 12.52 758115 6.734 59219 16 13.25 1219573 10.833 98658 17 13.76 58442 0.519 3959 18 14.73 3671419 32.613 336398 19 15.47 30600 0.272 2108 20 15.93 2390 0.021 307 21 16.41 6980 0.062 639 22 16.64 11897 0.106 836 23 17.13 29606 0.263 2312 24 17.44 89791 0.798 7748 25 17.76 214488 1.905 18327 26 18.13 1863598 16.554 153058 27 18.56 29056 0.258 2564 28 19.05 16121 0.143 1090 29 19.44 0 0 0 11257597 100 1149811 0 . 6 9 1 . 0 4 1 . 2 3 1 . 4 5 1 . 5 1 2 . 2 7 3 . 9 3 5 . 3 2 6 . 3 7 8 . 6 1 9 . 2 0 1 0 . 9 5 1 2 . 1 7 1 2 . 5 2 1 3 . 2 5 1 3 . 7 6 1 4 . 7 3 1 5 . 4 7 1 5 . 9 3 1 6 . 4 1 1 6 . 6 4 1 7 . 1 3 1 7 . 4 4 1 7 . 7 6 1 8 . 1 3 1 8 . 5 6 1 9 . 0 5 1 9 . 4 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) 111 Anexo 52: Vanilla planifolia curada de setiembre del 2007 (extracción en medio acuoso: 150 μL Viscozima + 300 μL Celuclast, 8 horas), 230 nm No. RT Area Area % Height 1 0.71 0 0 0 2 1.04 1935943 6.425 491394 3 1.21 361610 1.2 67127 4 1.45 153125 0.508 34946 5 1.51 806688 2.677 108195 6 2.27 141452 0.469 6088 7 3.21 141122 0.468 4027 8 3.48 39480 0.131 3146 9 3.93 209720 0.696 5209 10 5.33 1380522 4.582 74412 11 6.36 21537 0.071 980 12 6.75 9320 0.031 297 13 7.51 28120 0.093 927 14 8.57 144658 0.48 6237 15 9.19 496771 1.649 23055 16 10.95 130469 0.433 7167 17 11.8 117597 0.39 8128 18 12.17 63929 0.212 4948 19 12.52 1243702 4.128 96610 20 13.25 1111493 3.689 85995 21 14.31 14081 0.047 1484 22 14.81 20248054 67.199 1375496 23 15.47 447074 1.484 42452 24 15.75 5585 0.019 541 25 16.4 39358 0.131 3106 26 16.63 61143 0.203 4429 27 17.15 51511 0.171 2821 28 17.44 172228 0.572 12590 29 17.77 83679 0.278 6322 30 18.13 429681 1.426 32613 31 19.04 38665 0.128 1979 32 19.44 3320 0.011 333 30131637 100 2513054 0 . 7 1 1 . 0 4 1 . 2 1 1 . 4 5 1 . 5 1 2 . 2 7 3 . 2 1 3 . 4 8 3 . 9 3 5 . 3 3 6 . 3 6 6 . 7 5 7 . 5 1 8 . 5 7 9 . 1 9 1 0 . 9 5 1 1 . 8 0 1 2 . 1 7 1 2 . 5 2 1 3 . 2 5 1 4 . 3 1 1 4 . 8 1 1 5 . 4 7 1 5 . 7 5 1 6 . 4 0 1 6 . 6 3 1 7 . 1 5 1 7 . 4 4 1 7 . 7 7 1 8 . 1 3 1 9 . 0 4 1 9 . 4 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Retention Time (min) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 In te ns it y (A U) RESUMEN E INDICE TEORIA PARTE EXPERIMENTAL Y RESULTADOS ANEXOS