PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL PERÚ FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERÍA Caracterización de compuestos epicuticulares del árbol Triplaris americana TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN CIENCIAS CON MENCIÓN EN QUÍMICA AUTOR Jorge Emiliano Deustua Stahr ASESOR: Dr. Eric Gabriel Cosio Caravasi Lima, mayo, 2019 Resumen Triplaris americana es un árbol de la familia de las poligonáceas que tiene una relación simbiótica mutualista con hormigas de la especie Pseudomyrmex triplarinus. Este árbol, que pertenece al grupo de mirmecofitas debido a su afiliación con hormigas, es defendido de herbívoros y parásitos por las hormigas mientras que éstas utilizan el árbol a su favor como nido para la colonia. Este tipo de relaciones simbióticas son sumamente interesantes para muchas áreas de la biología, especialmente para la ecología química y, por lo tanto, su estudio es relevante. Las ceras epicuticulares son compuestos lipofílicos que forman un revestimiento que cubre todas las partes aéreas de una planta y es fundamental para su supervivencia. Evitan que la planta sufra de una deshidratación descontrolada mientras que también defienden a la planta de patógenos, radiación UV, polvo y polen. Además, son el medio de señalización con el que las plantas interactúan con otras especies, especialmente insectos, mediante compuestos químicos que los insectos son capaces de detectar. El objetivo de esta tesis es estudiar la química de las ceras epicuticulares de Triplaris americana con la aspiración a comprender con más detalle la relación simbiótica entre Pseudomyrmex triplarinus y este árbol desde la perspectiva química. Para esto, se analizaron las ceras extraídas de hojas de Triplaris americana mediante métodos cromatográficos y espectroscópicos. El resultado fue un perfil de concentraciones relativas de compuestos altamente hidrofóbicos que provee información útil para un posterior análisis de su función en relación con la percepción de las hormigas. i Agradecimientos Al Prof. Dr. Eric Cosio por los buenos chistes y el buen humor. A mis padres, hermana y familia por la paciencia y el cariño. A mis amigos por lo mismo. A la Lic. Eliana Esparza y a Lic. Fabian Limonchi por el constante apoyo durante esta aventura llamada tesis, con muchas ideas, discusiones y asistencia en el trabajo de campo. Al Prof. Dr. Javier Nakamatsu por haberme entregado su fascinación por la ciencia. A mis compañeras de laboratorio: Sandra Nakandakari, Brenda D’Acunha y Antonella Hadzich por ser lo máximo, por el apoyo, por la amistad y, sobre todo, por las risas. ii Tabla de contenidos 1. Introducción .............................................................................................................. 1 1.1 Las mirmecofitas ................................................................................................ 2 1.2 El género Triplaris ............................................................................................. 4 1.3 Triplaris americana ........................................................................................... 5 1.4 Pseudomyrmex triplarinus ................................................................................. 8 1.5 La cutícula y las ceras epicuticulares ............................................................... 10 1.6 Biosíntesis de ceras .......................................................................................... 15 2. Objetivos ................................................................................................................. 19 2.1 Objetivo general ............................................................................................... 19 2.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 19 3. Materiales y métodos .............................................................................................. 20 3.1 Materiales ......................................................................................................... 20 3.1.1 Solventes ................................................................................................... 20 3.1.2 Reactivos .................................................................................................. 21 3.1.3 Estándares ................................................................................................. 21 3.1.4 Gases ......................................................................................................... 22 3.1.5 Instrumentos ............................................................................................. 22 3.1.6 Material vegetal ........................................................................................ 23 3.2 Métodos ........................................................................................................... 26 3.2.1 Extracción de ceras epicuticulares por inmersión en solvente ................. 26 3.2.2 Extracción crioadhesiva de ceras .............................................................. 27 iii 3.2.3 Extracción de ceras por goteo con pipeta Pasteur .................................... 28 3.2.4 Derivatización con BSTFA ...................................................................... 28 3.2.5 Estándar de alcanos lineales ..................................................................... 29 3.2.6 Cromatografía de gases ............................................................................ 30 3.2.7 Análisis de datos ....................................................................................... 30 4. Resultados ............................................................................................................... 32 4.1 Estándares de alcanos ...................................................................................... 32 4.2 Alcanos lineales saturados ............................................................................... 33 4.3 Alcoholes primarios ......................................................................................... 35 4.4 Aldehídos ......................................................................................................... 37 4.5 Ácidos Grasos .................................................................................................. 39 4.5.1 Ácidos grasos insaturados ........................................................................ 41 4.6 Triterpenoides .................................................................................................. 43 4.7 Tocoferoles ...................................................................................................... 44 4.8 Ceras totales ..................................................................................................... 45 5. Discusión ................................................................................................................ 47 5.1 Material vegetal ............................................................................................... 47 5.2 Alcanos ............................................................................................................ 47 5.3 Ácidos grasos ................................................................................................... 49 5.4 Alcoholes ......................................................................................................... 50 5.5 Aldehídos ......................................................................................................... 52 5.6 Triterpenoides .................................................................................................. 53 iv 5.7 Tocoferoles ...................................................................................................... 55 6. Conclusiones ........................................................................................................... 57 7. Bibliografía ............................................................................................................. 59 v Tabla de abreviaciones AMDIS Automated Mass-Spectral Deconvolution and Identification System CoA coenzima A BSTFA N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida GC cromatografía de gases MS espectrometría de masas NIST National Institute of Standards and Technology PET polietilentereftalato PFBHA O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil)hidroxilamina PUCP Pontificia Universidad Católica del Perú RMN resonancia magnética nuclear UNALM Universidad Nacional Agraria La Molina vi Índice de Tablas Tabla 1. Tiempos de retención de la solución de alcanos estándar. ............................... 32 Tabla 2. Abundancias relativas al componente mayoritario de alcanos lineales en extractos de Triplaris americana con distintos métodos de extracción. ........................ 34 Tabla 3. Abundancias relativas al componente principal de alcoholes de cadena larga en Triplaris americana. ....................................................................................................... 36 Tabla 4. Abundancias relativas de aldehídos en extractos de Triplaris americana comparado por métodos de extracción. .......................................................................... 38 Tabla 5. Porcentajes relativos al compuesto mayoritario de ácidos grasos. ................... 40 Tabla 6. Abundancias relativas de ácidos grasos insaturados en comparación con ácido hexanoico que es el ácido graso mayoritario. ................................................................. 42 Tabla 7. Abundancias de los triterpenos mayoritarios relativas al componente principal. ........................................................................................................................................ 43 Tabla 8. Abundancias relativas de tocoferoles en comparación con ácido hexanoico. .. 45 vii Índice de Figuras Figura 1. Interior del domacio de un tallo joven de Triplaris americana. ....................... 3 Figura 2. Tronco de una Triplaris americana adulta en “Tangarana alley”, Reserva Nacional de Tambopata, Madre de Dios, Perú. ................................................................ 7 Figura 3. Detalle del tallo de Triplaris americana donde se observa el acceso a los domacios y algunos ejemplares de Pseudomyrmex triplarinus. ....................................... 9 Figura 4. Esquema en el que se muestra la disposición de las capas cuticulares y epicuticulares sobre la epidermis. (Müller y col., 2005). ............................................... 11 Figura 5. Aspecto común de ceras epicuticulares adaxiales. Micrografía electrónica (Sousa y col., 2003). ....................................................................................................... 11 Figura 6. Estructura de: alcanos lineales (a), alcoholes primarios lineales (b), ácidos grasos lineales (c) y aldehídos lineales (d). .................................................................... 13 Figura 7. Estructura química de los tocoferoles α, β, γ y δ. ........................................... 14 Figura 8. Esqueletos de los principales Triterpenoides vegetales. Lupano (a), Ursano (b), Oleanano (c) y Friedelina (d).......................................................................................... 15 Figura 9. Ruta biosintética de ceras vegetales (adaptado de Samuels y col., 2008)....... 18 Figura 10. Ubicación de la Reserva Nacional de Tambopata (a), ampliación de la reserva y ubicación de zona de muestreo (b) y ampliación de los alrededores del Explorer’s Inn cerca a la desembocadura del río La Torre sobre el río Tambopata(c) (Google Maps, 2014). .............................................................................................................................. 24 Figura 11. Ubicación de la ciudad de Lima (a), ampliación de la ciudad de Lima y ubicación de la Universidad Nacional Agraria La Molina (b) y ampliación de la universidad (c) y zona de muestreo (d) (Google Maps, 2014). ...................................... 25 Figura 12. Hojas de Triplaris americana de diferentes tamaños recién lavadas en el laboratorio. ...................................................................................................................... 26 viii Figura 13. Mecanismo de la reacción de derivatización con BSTFA (Supelco, 1997). . 29 Figura 14. Abundancia relativa de alcanos mayoritarios en comparación al componente principal. ......................................................................................................................... 35 Figura 15. Abundancia relativa de alcoholes mayoritarios en comparación al componente principal. ......................................................................................................................... 37 Figura 16. Abundancias relativas de aldehídos en extractos de Triplaris americana comparado por métodos de extracción. .......................................................................... 39 Figura 17. Abundancias relativas en comparación al compuesto mayoritario. .............. 41 Figura 18. Abundancias relativas de ácidos grasos insaturados en comparación con ácido hexanoico que es el ácido graso mayoritario. ................................................................. 42 Figura 19. Abundancias relativas de triterpenos comparadas por método de extracción. ........................................................................................................................................ 44 Figura 20. Abundancias relativas de tocoferoles en función de ácido hexanoico. ......... 45 Figura 21. Abundancia relativa de ceras totales en función de la suma de todas las concentraciones. ............................................................................................................. 46 Figura 22. Espectro de masas de n-hentriacontano C31H64. Nótese el patrón característico de las masas de los fragmentos de un alcano lineal. ....................................................... 48 Figura 23. Espectro de masas de ácido n-octadecanoico................................................ 49 Figura 24. Espectro de masas de 1-trimetilsiloxy-hexacosano....................................... 51 Figura 25. Espectro de masas de tetracosanal. ............................................................... 53 Figura 26. Espectro de masas de trimetilsilil-α-tocoferol. ............................................. 56 ix 1. Introducción Los bosques tropicales, como la Amazonía, son lugares de muy alta biodiversidad y de gran biomasa. Millones de especies habitan estos bosques en una intensa y constante competencia por la supervivencia. En este ecosistema tan dinámico las plantas son atacadas constantemente por herbívoros, parásitos e incluso otras plantas (Coley y Barone, 1996). Esta presión ecológica ha conducido a muchas especies vegetales a evolucionar diversos mecanismos de defensa, metabólicamente costosos, que son fundamentales para la estabilidad y bienestar del ecosistema amazónico. Las mirmecofitas son un grupo de plantas que han evolucionado junto con especies de hormigas construyendo relaciones simbióticas mutualistas. Algunas de estas relaciones planta-hormiga tienen la particularidad de funcionar como un mecanismo de defensa en favor de la planta. Las hormigas utilizan la planta como hogar y, a cambio del hospedaje, la defienden de posibles agresores. De esta manera, las mirmecofitas aseguran una ventaja con respecto a otras especies en sus ecosistemas. (Schremmer, 1984; Brandbyge, 1986). Triplaris americana es una especie poco estudiada de árboles perteneciente al grupo de las mirmecofitas y es un gran ejemplo de simbiosis planta-hormiga en el bosque amazónico. Desde la perspectiva de la ecología química, uno puede analizar el funcionamiento de estas relaciones simbióticas a un nivel molecular. Para esto, esta tesis busca analizar la química de las ceras epicuticulares de Triplaris americana, que cubren todas las partes aéreas de la planta (e.g. tallos, hojas, petalos, frutas, etc.), y que son el primer punto de contacto con insectos y otros organismos, para así poder eventualmente indagar sobre los mecanismos mediante los cuales las hormigas identifican los árboles que habitan mediante sus órganos sensoriales. Esta información, además, servirá 1 posteriormente para entender determinados aspectos subyacentes a esta relación simbiótica planta-hormiga. 1.1 Las mirmecofitas Las plantas han desarrollado varios tipos de defensas contra herbívoros y parásitos a lo largo de su evolución: físicos, como las espinas; químicos, como la producción de metabolitos secundarios tóxicos en hojas y tallos; ilusorios, como la formación de hojas de colores engañosos que se asemejan a depredadores naturales; etc. El éxito de estas defensas, sin embargo, no es siempre completo. Muchas especies de depredadores evolucionaron a la par de estas defensas desarrollando, por ejemplo, resistencias a metabolitos secundarios tóxicos que tienen la función de disuadir herbívoros. La especie Triplaris americana es un árbol perteneciente a una clase de plantas que poseen un sistema particular de defensa. Esta especie, junto con la especie de hormigas Pseudomyrmex triplarinus, han desarrollado una relación simbiótica mutualista en la que P. triplarinus se ha convertido en el “ejército defensor” del árbol T. americana a cambio de alimento y de un lugar para la colonia. Este tipo de defensa de hormigas residentes, llamado mirmecofilia, sólo ha sido eludido por pocos organismos herbívoros en contraste con defensas químicas y físicas (Heil y McKey, 2003), y por lo tanto hace del árbol una especie mucho más exitosa dentro del ecosistema de la Amazonía. Este tipo de relaciones simbióticas mutualistas entre planta y hormiga no es poco común. Existen muchas especies de árboles mirmecofitas, como por ejemplo árboles del género Tococa, Acacia, Cecropia, Triplaris, Tachigali, etc. El hábitat de la mayoría de éstos se concentra en la Amazonía y en bosques tropicales africanos; no obstante, se han reportado especies mirmecofitas incluso en Asia y Australia, generalmente en zonas tropicales (Davidson y col, 1993). 2 A nivel fisiológico, la mayor parte de las mirmecofitas evolucionaron estructuras llamadas domacios para albergar las colonias de hormigas. Estas consisten en estructuras huecas al interior de troncos, tallos u hojas de la planta (figura 1). Ocasionalmente, algunas mirmecofitas proveen de alimento a las hormigas mediante nectarios y en algunos casos cuerpos de alimento (Heil y McKey, 2003). Figura 1. Interior del domacio de un tallo joven de Triplaris americana. Finalmente, el entendimiento de estos mutualismos ha sido clave para el estudio y prueba de la Teoría de la Defensa de Plantas así como para la biología evolutiva y otros campos de la ecología como, por ejemplo, las redes alimenticias. Estudios recientes sugieren que este tipo de relaciones planta-hormiga son de suma importancia para la estructuración de redes de alimentación en los doseles de bosques tropicales (Heil y 3 McKey, 2003). A pesar de estos estudios, falta mucho por entender sobre este tipo de simbiosis planta-hormiga y, en especial, existe muy poca información sobre el género Triplaris. 1.2 El género Triplaris El género Triplaris pertenece a la familia Polygonaceae. Todas las especies crecen rápidamente y consiguen alturas medianas, y ocasionalmente, altas. El tronco es recto, liso y ramificado solamente en el tercio superior del árbol de tal manera que la corona del árbol adquiere forma piramidal. Suelen reproducirse vegetativamente mediante esquejes. Los individuos cortados o talados frecuentemente producen brotes del muñón. (Brandbyge, 1986). Las estípulas son cilíndricas y caducas, y llegan a 32 cm de longitud. Su estructura es muy parecida a las de los géneros Ficus y Magnoli. Son pilosos por fuera y glabros por dentro. El género Triplaris es estrictamente dioico, lo que quiere decir que los sexos masculino y femenino se encuentran siempre en individuos separados. Por otro lado, las inflorescencias son terminales y muy conspicuas al momento de formar el fruto. Las inflorescencias estaminadas son sésiles o subsésiles y, por eso, tiene forma de lanza. Están siempre rodeadas de un pequeño bracto. Las inflorescencias pistiladas son fundamentalmente parecidas a las estaminadas. Las flores estaminadas son bastante diferentes a las pistiladas especialmente en tamaño. (Brandbyge, 1986). Los frutos de Triplaris poseen alas y, por lo tanto, su principal medio de dispersión es el viento. Caen suavemente al piso, como un paracaídas, y por esta razón tienen la posibilidad de dispersarse a distancias medianas al árbol. Sin embargo, distancias más largas son imposibles debido al peso del fruto y la densidad del bosque. (Brandbyge, 1986). 4 Triplaris es un género de tierras bajas. Habita en un rango de alturas entre 0 y aproximadamente 2000 m sobre el nivel del mar; no obstante, la mayor cantidad de especies sobreviven a alturas menores a 1000 m. Con frecuencia, están restringidas a hábitats húmedos y abiertos como el bosque Amazónico. Todas las especies son pioneras en claros del bosque y son fundamentales en todas las etapas de sucesiones secundarias. Las especies están principalmente distribuidas entre Panamá y Brasil y la mayor concentración de especies ocurre en la región sud-oeste de la cuenca del Amazonas (Brandbyge, 1986). 1.3 Triplaris americana Triplaris americana es una planta perteneciente a las mirmecofitas, al igual que 20 de las 25 especies del género Triplaris, debido a su importante afiliación con Pseudomyrmex triplarinus. En el Perú, Triplaris americana es normalmente conocida con los nombres Tangarana o Palo santo. Es un árbol de estatura mediana entre 10 y 20 m de altura con troncos estrechos de aproximadamente 30 cm de diámetro, como se puede apreciar en la Figura 2. Posee una corteza suave con manchas de color gris que encarna una serie de espacios vacíos internos, domacios (ver la Figura 1), que como en la mayoría de mirmecofitas están especialmente dedicados a hospedar a las hormigas (Brandbyge, 1986). Triplaris americana es la especie más extendida del género. Habita en un rango desde Panamá (Provincia de Darién) hasta el sur de Brasil (Goyaz y Paraná). Ocupa zonas de alturas entre 200 m y 1000 m sobre el nivel del mar, en riberas de río o zonas de bosque secundario con tipos de vegetación más seca. Las hojas de Triplaris americana son ovaladas, 2-2,5 veces más largas que anchas. Tienen dimensiones de entre 25-35 cm de largo por 10-16 cm de ancho. Tienen una forma 5 puntiaguda, son lisas en el lado adaxial y ligeramente pilosas en el lado abaxial. Poseen entre 20-30 pares de venas laterales (Brandbyge, 1986). 6 Figura 2. Tronco de una Triplaris americana adulta en “Tangarana alley”, Reserva Nacional de Tambopata, Madre de Dios, Perú. 7 1.4 Pseudomyrmex triplarinus Pseudomyrmex triplarinus (Figura 3) pertenece a un género de hormigas de aguijón, territoriales y muy agresivas. Estas hormigas colonizan su árbol hospedador desde una etapa temprana de su crecimiento, cuando tiene alrededor de 50 cm de altura (Schremmer, 1984). P. triplarinus, como también otras especies del género Pseudomyrmex, son totalmente dependientes de T. americana. Estas hormigas han perdido la capacidad de construir sus propios nidos (Schremmer, 1984), por lo tanto, las estructuras huecas del árbol (domacios) son el único lugar en donde pueden habitar. A pesar de que muchas plantas mirmecofitas proveen sustancias nutritivas a las hormigas mediante nectarios ricos en aminoácidos y azúcares; y cuerpos de glucógeno y proteína, T americana no posee estas cualidades y, por lo tanto, la alimentación de las hormigas ocurre mediante un tercer organismo involucrado en la simbiosis (Bentley, 1977; Fonseca y Ganade, 1996). Se trata de pequeños artrópodos blancos de la especie Dysmicoccus brevipes de la familia Pseudococcidae. Estos insectos viven junto con las hormigas dentro de los domacios y producen una suerte de miel que es la fuente de alimento de las hormigas (Schremmer, 1984). En relación con el árbol, P. triplarinus cumple con su parte de la relación simbiótica mediante sus características guerreras. Utilizando sus grandes pinzas y doloroso veneno, las hormigas atacan prácticamente a cualquier intruso u objeto que entre en contacto con su árbol hospedador (Schremmer, 1984). Por ejemplo, estudios realizados por Weir y colaboradores (2011) muestran que sustancias como una hoja de papel son inmediatamente destruidas cuando se colocan en contacto con la superficie de T. americana. De esta manera, mantienen al árbol libre de herbívoros como también de parásitos e incluso se sospecha que mantienen el área aledaña al árbol libre de otras especies de plantas competidoras, otorgándole aún mayor ventaja (Curátola, 2009). 8 Figura 3. Detalle del tallo de Triplaris americana donde se observa el acceso a los domacios y algunos ejemplares de Pseudomyrmex triplarinus. Pseudomyrmex triplarinus puede identificar entre su árbol hospedador y cualquier otra especie, objeto, parásito, etc. Estas hormigas llegan incluso a distinguir entre su propio árbol y otros de la misma especie (Schremmer, 1984). Las hormigas identifican al árbol por medio de compuestos epicuticulares, alojados en hojas y tallos de T. americana que pueden detectar con la ayuda de órganos especializados llamados sensilos ubicados en las antenas de las hormigas (Ozaki y col., 2005). 9 1.5 La cutícula y las ceras epicuticulares La superficie de las plantas está delineada por una estructura denominada cutícula, que cumple labores fundamentales. La cutícula cubre esencialmente toda el aérea superficial de las plantas: todos los tallos, hojas, pétalos e incluso frutos de una planta. Es una barrera que protege a la planta de presiones externas ambientales. En cuanto a protección frente al estrés abiótico, sus principales funciones son: evitar la pérdida incontrolable de agua, proteger a la planta de radiación UV y ayudar a minimizar el depósito de polvo, polen y otros contaminantes (Shepherd y Griffiths, 1995; Reina-Pinto y Efremov, 2009; Bourdenx y col., 2011). Esta adaptación es clave en la evolución de las plantas terrestres y una evidencia de ello es la priorización de la producción de ceras de las células epidérmicas. Se calcula que más de la mitad de los ácidos grasos sintetizados por células epidérmicas son dirigidas a la cutícula (Samuels y col., 2008). Además, es la interface con el exterior y, por lo tanto, influencia interacciones con organismos ajenos a las plantas, especialmente insectos, mediante las ceras epicuticulares debido a que es la capa más accesible a los órganos sensoriales de los insectos (Müller y Riederer, 2005; Guhling y col., 2005). Un ejemplo de esta función entre especies está descrita en el trabajo de Bernays (1976) donde muestra que los saltamontes discriminan entre plantas comestibles y no-comestibles por medio del contacto de sus receptores químicos con las ceras epicuticulares. La cutícula es una capa altamente hidrofóbica conformada por dos materiales que cubren la epidermis del cuerpo de la planta. Uno de ellos es la cutina, un biopolímero formado a partir de ácidos grasos hidroxilados o epoxidados a media cadena de extensiones C16 y C18 inter-enlazados mediante grupos éster, y glicerol (Samuels y col., 2008; Müller y Riederer, 2005; Eglinton y col., 1967). El otro material, las ceras, se 10 encuentran sobre y en la cutícula y consisten de una mezcla de compuestos altamente lipofílicos de cadenas alifáticas muy largas conocida como ceras epicuticulares. Figura 4. Esquema en el que se muestra la disposición de las capas cuticulares y epicuticulares sobre la epidermis. (Müller y col., 2005). Figura 5. Aspecto común de ceras epicuticulares adaxiales. Micrografía electrónica (Sousa y col., 2003). 11 En el sentido químico de la palabra, las ceras son ésteres de ácidos grasos y alcoholes primarios de cadenas largas. Sin embargo, cuando se habla de las ceras epicuticulares, se suelen incluir dentro del término ceras a compuestos cíclicos como triterpenoides pentacíclicos y flavonoides. Típicamente, estos componentes constituyen entre 20% y 60% de la masa de la cutícula. Los compuestos principales de las ceras epicuticulares son ésteres de ácidos grasos, alcanos, alquenos, alcoholes de cadenas largas y compuestos cíclicos como flavonoides y terpenoides (Müller y Riederer, 2005). Los compuestos mayoritarios en estas categorías son alcanos lineales saturados C21-C35, alcoholes primarios C22-C40 y ácidos grasos C14-C18 y C20-C24; y aldehídos C24-C36, alcoholes secundarios C21-C35, cetonas C21-C35, β-dicetonas C22-C36 y ésteres n-alquilo C36-C60 con hidroxilaciones en media cadena. Por otra parte, los compuestos cíclicos contenidos en las ceras son ácidos triterpenoides pentacíclicos, alcoholes triterpenos, cetonas triterpenas, ésteres triterpenos, flavonoides, tocoferoles y glicósidos (Müller y Riederer, 2005; Wood y col., 2005; Guhling y col., 2005; Shepherd y Griffiths, 1995; Buschhaus y col., 2007). Estudios en Arabidopsis thaliana han concluido que la mayor parte de las ceras está constituida por alcanos y sus derivados provenientes de las rutas de síntesis de alcanos que llegan a formar el 70-80% de las ceras totales. 12 Figura 6. Estructura de: alcanos lineales (a), alcoholes primarios lineales (b), ácidos grasos lineales (c) y aldehídos lineales (d). 13 Figura 7. Estructura química de los tocoferoles α, β, γ y δ. En cuanto a los triterpenoides, se ha reportado una gran variedad de triterpenoides en ceras vegetales, especialmente ceras intracuticulares. Algunos ejemplos de estos son lupeol, α y β amirina, ácido ursólico, ácido oleanóico, friedelina y sus respectivos derivados (Figura 8) (Buschhaus y col., 2007; Nordby y col., 1994; Courtney y col., 1983). 14 Figura 8. Esqueletos de los principales Triterpenoides vegetales. Lupano (a), Ursano (b), Oleanano (c) y Friedelina (d). 1.6 Biosíntesis de ceras Las rutas biosintéticas de ceras no están completamente elucidadas aún. Sin embargo, estudios recientes de la especie modelo Arabidopsis thaliana han aportado al entendimiento de la biosíntesis y transporte de ceras epicuticulares vegetales (Bourdenx y col., 2011; Koorneef y col., 1989). Se identificaron y caracterizaron genes involucrados en dichos procesos y además se realizaron estudios bioquímicos que respaldaron estas 15 exploraciones. Las ceras son sintetizadas en las células epidérmicas de las plantas mediante la adición de bloques de C2 de acetil-coenzima A (acetil-CoA) para formar cadenas alifáticas de extensiones entre 24 y 34 carbonos. Esto ocurre en 3 etapas distintas. La primera etapa consiste en la producción de ácidos grasos C16 y C18 en los leucoplastos mediante la condensación de acetil-CoA con un grupo de dos carbonos de una proteína transportadora de malonil acilo (ACP) catalizada por el complejo de proteínas sintetizadoras de ácidos grasos (FAS). Los ácidos grasos C16 y C18 son parte de la lipogénesis general de la planta y son intermediarios centrales en todas las clases de lípidos esenciales para la planta (Harwood y col., 2005; Ohlrogge y col., 1995, Samuels y col., 2008). En la segunda etapa, parte de estos ácidos grasos son esterificados a CoA y son transportados al retículo endoplasmático mediante un proceso que no está completamente elucidado (Kunst y col., 2003). Allí, los ácidos grasos son elongandos por acción de enzimas ácido graso elongadoras para convertirse en ácidos grasos de cadena muy larga, entre C20 y C34 (Kunst y col., 2003; Samuels y col., 2008). De forma similar al proceso que ocurre en los leucoplastos para la producción de ácidos grasos de cadena corta (C16 y C18), la elongación ocurre en aumentos de grupos C2, provenientes de malonil-CoA y no de malonil-ACP. Se sabe que existen varias enzimas específicas para cada tamaño de cadena que catalizan este proceso, sin embargo no está todavía claro cuántas participan ni sus mecanismos de acción específicos. Estos compuestos elongados están principalmente dedicados a la producción de ceras epicuticulares (Samuels y col., 2008). La tercera etapa consiste en la reducción de los ácidos grasos elongados a los componentes principales de las ceras y está dividida en dos rutas importantes. La primera ruta consiste en la síntesis de alcoholes primarios de cadenas de C26, C28, C30 y C32 (Baker, 1982) y ésteres de grupos acilo, aromáticos, alifáticos largos (C16 y C18) y muy largos 16 (C24-C36) estos últimos pertenecientes a la etapa de elongación (Jetter y col., 2006). Los alcoholes primarios en ceras epicuticulares tienen normalmente la misma extensión, par, que los ácidos grasos elongados y por lo tanto se piensa que deben ser sintetizados mediante la reducción del grupo ácido. Estudios con Arabidopsis thaliana sugieren que la misma maquinaria de elongación en la etapa anterior es responsable de la reducción de los ácidos grasos a alcoholes primarios y que la ruta a través de un intermediario aldehído no es muy probable. Sin embargo, todavía existe muy poca evidencia para poder explicar completamente la maquinaria enzimática asociada a esta reducción (Samuels y col., 2008). Por otro lado, la segunda etapa consiste en la síntesis de alcoholes secundarios, alcanos y cetonas (Jetter y col., 2006). Los productos de esta síntesis se caracterizan por ser compuestos de cadenas impares de carbonos en contraste con los alcoholes primarios y ácidos grasos. Está establecido que, al igual que la producción de alcoholes primarios, la formación de estos compuestos de cadenas impares parte de los ácidos grasos de cadenas muy largas y que por lo tanto es un proceso que compite con la síntesis de alcoholes primarios. La evidencia experimental sugiere que es muy poco probable que la descarboxilación de ácidos grasos perteneciente a esta ruta ocurra directamente en el mismo paso que la elongación de ácidos grasos como parece suceder en la síntesis de alcoholes primarios. Por lo tanto, se piensa que esta reacción ocurre en pasos separados. Además, la biosíntesis de alcoholes secundarios y cetonas ocurre en pasos separados a partir de los alcanos que funcionan como intermediarios. La formación de alcanos se lleva a cabo mediante la pérdida en lugar de la adición de C1. Esto está confirmado mediante la evidencia de que compuestos homólogos de alcanos y de ácidos grasos presentes en ceras epicuticulares están desfasados entre sí por un carbono de tal manera que el alcano equivalente posee uno menos que el ácido graso (Samuels y col., 2008). Sin embargo, la 17 mecánica de estos procesos todavía queda por aclarar. Varias hipótesis se han planteado, y la más probable sugiere que el proceso ocurre mediante la descarboxilación de un aldehído intermediario (Figura 9) (Samuels y col., 2008). Figura 9. Ruta biosintética de ceras vegetales (adaptado de Samuels y col., 2008). 18 2. Objetivos 2.1 Objetivo general En vista de que la información bioquímica sobre Triplaris americana es casi inexistente, el objetivo general de esta tesis es determinar un perfil de compuestos presentes en la superficie de Triplaris americana mediante la caracterización de las ceras epicuticulares de las hojas. Esto, con el afán de contribuir a mejorar el entendimiento de la simbiosis entre Triplaris americana y Pseudomyrmex triplarinus mediante la identificación de compuestos químicos relevantes en la interacción. 2.2 Objetivos específicos El primer objetivo fue identificar y caracterizar los compuestos mediante la comparación de espectros de masas e índices de Kovats con información previamente reportada en la literatura. El segundo objetivo fue hallar un perfil de concentraciones relativas entre compuestos e identificar los compuestos mayoritarios de las ceras epicuticulares. Para lograr el objetivo general, se decidió separar las ceras epicuticulares en clases de compuestos: alcanos, alcoholes, aldehídos, ácidos grasos y terpenoides, debido a la complejidad de la mezcla en la epicutícula. Además, se comparó las diferencias entre métodos de extracción mecánicos y químicos para evaluar su especificidad en cuanto a la profundidad de extracción de ceras epicuticulares. 19 3. Materiales y métodos 3.1 Materiales 3.1.1 Solventes Se utilizaron solventes de grado analítico o cromatográfico (GC, HPLC) para todos los experimentos realizados en este trabajo de tesis y se utilizó agua purificada Tipo I (Milli Q, Millipore, Billerica, EE.UU.) Fisher Scientific (Nueva Jersey, EE.UU.) 1. Hexanos 2. Diclorometano JT Baker (Phillipsburg, EE.UU) 1. Acetona 2. Diclorometano 3. Cloroformo 4. Hexanos 5. Metanol Merck (Darmstadt, Alemania) 1. Cloroformo 2. n-Hexano 20 3.1.2 Reactivos Macherey-Nagel (Düren, Alemania) 1. Metil 8 2. BSTFA 3.1.3 Estándares Sigma Aldrich (St. Louis, EE.UU) 1. n-Octano C8H18 2. n-Nonano C9H20 3. n-Decano C10H22 4. n-Undecano C11H24 5. n-Tetradecano C14H30 6. n-Pentadecano C15H32 7. n-Hexadecano C16H34 8. n-Heptadecano C17H36 9. n-Octadecano C18H38 10. n-Nonadecano C19H40 11. n-Eicosano C20H42 12. n-Heneicosano C21H44 13. n-Docosano C22H46 14. n-Tetraeicosano C24H50 15. n-Octaeicosano C28H58 16. n-Dotriacontano C32H66 21 3.1.4 Gases Linde Gas (Lima, Perú) 1. Helio (UHP) 2. Nitrógeno (UHP) 3. Nitrógeno líquido (UHP) 4. Aire sintético 3.1.5 Instrumentos Agilent (Santa Clara, EE.UU.) 1. Cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 series II 2. Cromatógrafo de gases Agilent 7890B 3. Espectrómetro de masas cuadrupolo HP 5971 4. Espectrómetro de masas cuadrupolo Agilent 5977B 5. Columna de cromatografía de gases HP-5ms ((5%-fenil)-methilpolisiloxano), 30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 µm de espesor de fase estacionaria. 6. Columna de cromatografía de gases DB-5ms ((5%-fenil)-methilpolisiloxano), 30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 µm de espesor de fase estacionaria. Büchi (Flawil, Suiza) 1. Rota-evaporador, R-3 22 Pierce (Rockford, EE.UU) 1. Bloque termostatizado con agitación magnética, Reacti-ThermTM, módulo de calentamiento y agitación y unidad de evaporación. Genéricos 1. Bolsas para hornear PET 3.1.6 Material vegetal Todas las muestras de Triplaris americana fueron tomadas únicamente de dos lugares: la Reserva Nacional de Tambopata en Madre de Dios y la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM). Las recolecciones en la Reserva Nacional de Tambopata se llevaron a cabo en una zona denominada "Tangarana Alley" aproximadamente en la marca de 600 m de la trocha "Main" en los alrededores de la estación de investigación de la PUCP en los terrenos del albergue Explorer's Inn. En esta zona se encuentran aproximadamente 10 ejemplares de Triplaris americana de diferentes edades y estaturas. Las muestras fueron extraídas principalmente de individuos entre 1 m y 2 m de estatura debido a la dificultad de tomar muestras de árboles más grandes. Todos los individuos muestreados poseían colonias saludables de Pseudomyrmex triplarinus y por lo tanto la dificultad de muestreo se debe a las picaduras de las hormigas. Se tomaron directamente hojas seleccionadas o secciones periféricas de ramas nuevas que contenían hojas en buen estado y salud. Inmediatamente después, las muestras se colocaron en una caja de polietileno con tapa y se humedecieron ligeramente con agua para realizar el viaje a Lima en avión. Las muestras permanecieron entre 5 h y 48 h separadas de la planta antes de ser procesadas en el laboratorio. 23 Figura 10. Ubicación de la Reserva Nacional de Tambopata (a), ampliación de la reserva y ubicación de zona de muestreo (b) y ampliación de los alrededores del Explorer’s Inn cerca a la desembocadura del río La Torre sobre el río Tambopata(c) (Google Maps, 2014). Otras muestras se tomaron del campus de la UNALM, específicamente del jardín de la Facultad de Ingeniería Forestal. Allí se tomaron secciones de tallo con hojas, de ramas bajas de individuos entre 20 m y 30 m de altura. Ninguno de estos árboles albergaba colonias de Pseudomyrmex triplarinus debido principalmente al clima de la ciudad de Lima. 24 Figura 11. Ubicación de la ciudad de Lima (a), ampliación de la ciudad de Lima y ubicación de la Universidad Nacional Agraria La Molina (b) y ampliación de la universidad (c) y zona de muestreo (d) (Google Maps, 2014). Una vez en el laboratorio, todas las muestras de Triplaris americana fueron lavadas con agua a presión, luego enjuagadas con agua destilada y finalmente secadas a temperatura ambiente por aproximadamente 2 horas. En este proceso se trató de minimizar la interferencia de contaminantes atmosféricos y biológicos. 25 Figura 12. Hojas de Triplaris americana de diferentes tamaños recién lavadas en el laboratorio. 3.2 Métodos 3.2.1 Extracción de ceras epicuticulares por inmersión en solvente Una vez en el laboratorio las muestras fueron sometidas a una extracción por solvente. Las hojas de T. americana se remojaron brevemente en una bandeja de vidrio borosilicato con aproximadamente 400 mL de solvente y cubierta por un pliego de papel aluminio para evitar la evaporación del solvente y la condensación de agua del ambiente. Se realizaron extracciones con n-hexano, diclorometano y cloroformo, con diferentes tiempos y número de sumersiones por hoja. Se intentó, en la medida de lo posible, no 26 permitir que el solvente alcance la epidermis y el interior de la hoja. Luego la solución resultante se evaporó hasta total sequedad en un rotaevaporador utilizando temperaturas y presiones favorables para el tipo de solvente empleado. El sólido blanco resultante fue luego disuelto en 5 mL de solvente y colocado en un vial. A continuación, la solución de 5 mL fue concentrada, bajo flujo de N2 gas y ligero calentamiento, hasta aproximadamente 300 µL (Shepherd y col., 1995). Finalmente, esta solución se utilizó en los ensayos cromatográficos. 3.2.2 Extracción crioadhesiva de ceras En paralelo a la extracción por solvente, se realizaron extracciones crioadhesivas (Riedel y col., 2003). Un grupo de hojas lavadas fueron cortadas en pedazos cuadrados de 2cm de largo por 2cm de ancho aproximadamente. Estos pedazos fueron luego sumergidos en agua destilada y luego colocados entre dos monedas de aluminio de aproximadamente 1 cm de diámetro. A continuación, se sumergió el sistema nuevamente en agua destilada y luego en nitrógeno líquido manteniendo la presión entre las monedas con una pinza. Una vez congelada la muestra, se procedió a retirar las monedas del nitrógeno e, inmediatamente, a separar la moneda colocada en la zona adaxial de la hoja. De esta manera, se logra arrancar únicamente las ceras epicuticulares de la hoja bajo la moneda de aluminio. Finalmente las monedas fueron colocadas en un Erlenmeyer aproximadamente 200ml de diclorometano. Este proceso se repitió con 25 monedas. A continuación, se introdujo el Erlenmeyer con las monedas dentro de un baño ultrasónico. Se dejó uniformizar la mezcla por 15 min en ultra sonido. Luego se separó la parte orgánica de la parte acuosa (resultado del proceso crioadhesivo) de la solución y se evaporó a sequedad. El sólido blanco resultante fue disuelto en 5 mL de diclorometano o 27 cloroformo y luego se colocó en un vial. Finalmente, bajo flujo de nitrógeno gas y leve calentamiento, se concentró la solución hasta 300 µL. 3.2.3 Extracción de ceras por goteo con pipeta Pasteur Además de los métodos anteriores, se extrajeron ceras epicuticulares utilizando la acción de bombeo de pipetas Pasteur (Feakins y Sessions, 2010). Se vertieron 5 mL de cloroformo en vaso de precipitado de 100 mL. A continuación, con ayuda de la pipeta Pasteur se procedió a succionar un poco del solvente y luego esparcirlo por ambos lados de una hoja de Triplaris americana, previamente lavada, de tal manera que el solvente caiga dentro del vaso de precipitado arrastrando las ceras. Este procedimiento se repitió 10 veces. A continuación, la solución resultante fue colocada en un vial de 5 mL y luego se procedió a evaporar bajo flujo de nitrógeno hasta alcanzar aproximadamente los 300 µL de solución. 3.2.4 Derivatización con BSTFA Para determinar los compuestos extraídos de las plantas, se trabajó principalmente con cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas (GC-MS). La polaridad de los grupos polares OH de alcoholes y ácidos grasos presentes en las muestras interaccionan fuertemente con silanoles libres en la columna cromatográfica imposibilitando una buena separación y, por lo tanto, una buena identificación de una serie de compuestos. Por esta razón, la derivatización de los grupos OH a grupos trimetilsilil apolares es necesaria para el análisis cromatográfico. Para esto se evaporaron a sequedad las soluciones obtenidas de las extracciones y se redisolvieron en 20 µL de N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (BSTFA) en un vial de 2 mL con inserto de 200 28 µL. A continuación la solución fue calentada a 130°C por 20 minutos y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. Luego, la solución resultante fue evaporada a sequedad bajo flujo de nitrógeno para luego redisolverla en 125 µL de cloroformo en un vial con un inserto de 200 µL. Figura 13. Mecanismo de la reacción de derivatización con BSTFA (Supelco, 1997). 3.2.5 Estándar de alcanos lineales Para poder calcular el índice de retención de Kovats, es necesario realizar un cromatograma de alcanos lineales conocidos. Para esto se preparó una solución de 16 alcanos a partir de estándares puros de la marca Sigma-Aldrich en diclorometano. Se utilizaron los siguientes n-alcanos: C8, C9, C10, C11, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C28 y C32. La solución final de la mezcla de alcanos, tuvo una concentración de 1,3 mg/mL de cada uno de ellos. 29 3.2.6 Cromatografía de gases Todas las muestras fueron separadas por cromatografía de gases y analizadas por espectrometría de masas. La cromatografía de gases se llevó a cabo en dos equipos: un HP 5890 Serie II acoplado a un espectrómetro de masas tipo cuadrupolo HP 5971 y un Agilent 7890B acoplado a un espectrómetro de masas tipo cuadrupolo Agilent 5977B. Se utilizaron columnas no polares DB5 (30 m x 0,25 mm d.i., 0,25 μm) en el equipo HP y HP5MS (30 m x 0,25 mm d.i., 0,25 μm) en el equipo Agilent. Se utilizó Helio UHP, como gas portado, con un flujo constante de 0.9 mL/min mantenido electrónicamente. El volumen de inyección fue de 1,0 μL de muestra, la temperatura del inyector, 280°C y la temperatura de la interfase al módulo de masas, 300°C. El programa de temperatura del horno consistió en un estado isotérmico a 60°C por 5 min seguido de un calentamiento de 10°C/min hasta 150°C y luego otro de 5°C/min hasta 310°C donde se mantuvo isotérmicamente por 15 min más. El espectrómetro de masas estuvo configurado para funcionar en modo de ionización electrónica con una energía de ionización de 70 eV y en modo de barrido, escaneando desde 50 m/z hasta 600 m/z. 3.2.7 Análisis de datos Los datos adquiridos mediante este instrumento fueron revisados y analizados utilizando el software AMDIS y NIST. Estos programas permiten manipular y, sobretodo, permiten identificar compuestos mediante la comparación de similitudes entre los espectros obtenidos experimentalmente y los contenidos en las bases de datos del NIST 2011. Asimismo, se calcularon los índices de Kovats de todos los compuestos analizados. Los índices de Kovats se calculan utilizando los tiempos de retención cromatográficos de cada compuesto analizado y de una mezcla estándar de alcanos de 30 longitudes conocidas. Los índices de Kovats a diferencia de los tiempos de retención permiten comparar separaciones cromatográficas indistintamente de los equipos y condiciones. De tal manera es posible utilizar datos cromatográficos previamente calculados y mantenidos en una base de datos. El índice de Kovats para una cromatografía no isotérmica se calcula de la siguiente manera. Ecuación 1 𝑡𝑟(𝑑𝑒𝑠𝑐𝑜𝑛𝑜𝑐𝑖𝑑𝑜) − 𝑡𝑟(𝑛) 𝐼 = 100 × [𝑛 + (𝑁 − 𝑛) ] 𝑡𝑟(𝑁) − 𝑡𝑟(𝑛) Donde: I = Índice de retención de Kovats n = número de carbonos del n-alcano con tiempo de retención inmediatamente menor al desconocido. N = número de carbonos del n-alcano con tiempo de retención inmediatamente mayor al desconocido. tr = tiempo de retención 31 4. Resultados 4.1 Estándares de alcanos Se analizó mediante cromatografía de gases la solución de estándares de alcanos lineales previamente preparada. Del cromatograma obtenido se anotaron los tiempos de retención para poder calcular los índices de Kovats para todas las muestras. Alcano Tiempo de retención (min) C10 7,8852 C11 10,0470 C14 14,8758 C15 16,4253 C16 18,0967 C17 19,866 C18 21,6907 C19 23,5269 C20 25,3597 C21 27,1478 C22 28,8913 C24 32,2038 C28 38,1879 C32 43,4219 Tabla 1. Tiempos de retención de la solución de alcanos estándar. 32 4.2 Alcanos lineales saturados El resultado del análisis de alcanos utilizando los tres métodos de extracción es bastante parecido. Todas las muestras analizadas contienen n-hentriacontano (C31H64) seguido de n-nonacosano y finalmente n-heptacosano, mayoritariamente. Se encontraron alcanos de longitudes menores pero en proporciones bastante menores a los anteriores. Tanto la extracción por sumersión en solvente como crioadhesiva presentaron alcanos. La extracción por lavado con solvente extrajo únicamente los compuestos más abundantes y además en menor concentración. Los alcanos lineales saturados fueron observados tanto en muestras derivatizadas con BSTFA como muestras sin derivatizar. 33 Extracción Extracción Alcanos Extracción por sumersión en por lavado con lineales crioadhesiva solvente solvente C13 0,05% C14 0,43% C15 0,16% C16 C17 0,81% C18 0,55% 0,20% C19 0,52% C20 0,76% 1,01% C21 0,68% 0,21% C22 1,20% 1,30% C23 2,27% 2,79% C24 2,32% 4,04% C25 4,70% 11,03% C26 4,69% 8,22% C27 10,29% 4,58% 29,09% C28 5,29% 10,70% C29 55,36% 60,97% 52,55% C30 7,33% 10,41% C31 100,00% 100,00% 100,00% C32 4,02% Tabla 2. Abundancias relativas al componente mayoritario de alcanos lineales en extractos de Triplaris americana con distintos métodos de extracción. 34 120.00% 100.00% 80.00% 60.00% C27 40.00% C29 C31 20.00% 0.00% Extracción por Extracción por Extracción sumersión en lavado con solvente crioadhesiva solvente Método de extracción Figura 14. Abundancia relativa de alcanos mayoritarios en comparación al componente principal. 4.3 Alcoholes primarios Se encontraron alcoholes de extensiones entre 12 y 30 carbonos siendo los más abundantes n-triacontanol (C30), n-octacosanol (C28) y n-hexacosanol (C26). Mediante las extracciones por sumersión en solvente y por lavado con solvente el alcohol predominante es n-triacontanol (C30) seguido de n-octacosanol (C28); mientras que mediante extracción criogénica el alcohol mayoriario es n-hexacosanol (C26) seguido de n-triacontanol (C28). Estos resultados fueron observados en muestras derivatizadas con BSTFA. El método de sumersión en solvente extrajo la mayor variedad de compuestos, mientras que el método de lavado por solvente extrajo la menor. 35 Porcentaje del mayoritario Extracción Extracción Alcoholes Extracción por sumersión en por lavado con lineales crioadhesiva solvente solvente C12 0,37% C13 C14 0,20% C15 C16 C17 C18 7,15% 2,29% 3,94% C19 C20 C21 C22 1,39% C23 C24 8,30% 1,17% 51,09% C25 1,97% C26 13,40% 4,82% 100,00% C27 C28 55,11% 27,55% 99,93% C29 C30 100,00% 100,00% 50,26% Tabla 3. Abundancias relativas al componente principal de alcoholes de cadena larga en Triplaris americana. 36 120.00% 100.00% 80.00% 60.00% C27 40.00% C29 C31 20.00% 0.00% Extracción por Extracción por Extracción sumersión en lavado con solvente crioadhesiva solvente Método de extracción Figura 15. Abundancia relativa de alcoholes mayoritarios en comparación al componente principal. 4.4 Aldehídos Los aldehídos más abundantes en las muestras de Triplaris americana son n- dotriacontanal (C32), n-triacontanal (C30) y n-octacosanal (C28). Tanto en las extracciones por lavado en solvente como por sumersión en solvente se mantiene este patrón, sin embargo en las extracciones crioadehesivas el compuesto mayoritario fue n- octacosanal (C28) seguido de n-triacontanal (C30) y finalmente n-dotriacontanal (C32). Estos resultados se obtuvieron principalmente de muestras sin derivatizar. 37 Porcentaje del mayoritario Extracción Extracción Aldehídos Extracción por sumersión en por lavado con lineales crioadhesiva solvente solvente C9 0,41% C10 0,15% C11 0,02% C12 0,04% C13 0,55% C14 0,08% C15 0,89% C16 0,05% C22 0,32% C24 27,84% 1,85% 16,66% C25 3,86% 0,51% C26 47,77% 7,25% 79,03% C27 4,96% 0,59% C28 78,04% 8,34% 100,00% C29 1,38% C30 82,33% 10,24% 55,91% C31 4,45% C32 100,00% 100,00% 46,37% Tabla 4. Abundancias relativas de aldehídos en extractos de Triplaris americana comparado por métodos de extracción. 38 120.00% 100.00% 80.00% 60.00% C28 40.00% C30 20.00% C32 0.00% Extracción por Extracción por Extracción sumersión en lavado con crioadhesiva solvente solvente Método de extracción Figura 16. Abundancias relativas de aldehídos en extractos de Triplaris americana comparado por métodos de extracción. 4.5 Ácidos Grasos Se encontró una variedad de ácidos grasos lineales de extensiones entre 9 y 32 carbonos en muestras derivatizadas con BSTFA. Al igual que el análisis de alcanos y alcoholes, mediante el método de extracción por sumersión en solvente se halló la mayor variedad de compuestos frente al método de lavado por solvente que extrajo la menor cantidad de solventes. Los ácidos grasos más abundantes en las ceras epicuticulares de Triplaris americana fueron, en orden de abundancia relativa, ácido hexadecanoico (C16), ácido octadecanoico (C18), ácido tetracosanoico (C24), ácido hexacosanoico (C26) y ácido tetradecanoico (C14). 39 Porcentaje del mayoritario Ácidos Extracción Extracción Extracción Grasos por sumersión en por lavado con crioadhesiva Lineales solvente solvente C6 0,44% C8 0,25% C9 0,85% 0,13% C10 0,11% 0,11% C11 1,51% C12 7,13% 5,82% 1,54% C13 0,43% 0,00% 0,92% C14 10,61% 4,09% 3,64% C15 4,68% 1,01% 0,63% C16 100,00% 100,00% 100,00% C17 2,70% 0,62% 0,29% C18 44,74% 59,65% 74,29% C19 C20 1,08% 0,51% C21 C22 4,73% 6,11% 0,16% C23 C24 19,83% 22,48% C25 1,67% 0,00% C26 13,06% 15,35% C27 C28 C29 C30 C31 C32 10,07% Tabla 5. Porcentajes relativos al compuesto mayoritario de ácidos grasos. 40 120.00% 100.00% 80.00% C14 60.00% C16 C18 40.00% C22 20.00% C24 C26 0.00% Extracción por Extracción por Extracción sumersión en lavado con solvente crioadhesiva solvente Método de extracción Figura 17. Abundancias relativas en comparación al compuesto mayoritario. 4.5.1 Ácidos grasos insaturados Además de los ácidos grasos lineales y saturados, se detectaron algunos ácidos grasos insaturados derivados de C16 y C18. Estos fueron identificados mediante la comparación de espectros de masa con otros reportados en la base de datos NIST y de índices de retención. Los compuestos más abundantes de esta clase fueron el ácido oleico y linoleico. Los resultados fueron tomados de análisis de muestras derivatizadas con BSTFA. 41 Porcentaje del mayoritario Extracció Extracció Ácidos Extracció n por sumersión n por lavado con insaturados n crioadhesiva en solvente solvente Ácido cis-9- Hexadecenoico 2,95% 0,88% 0,54% Ácido trans?-9- Hexadecenoico 2,62% Ácido Linoleico 5,83% 13,96% 7,13% Ácido Oleico 16,03% 66,76% 10,77% Ácido 11-trans- Octadecenoico 1,24% 0,88% 0,61% Ácido hexanoico 100,00% 100,00% 100,00% Tabla 6. Abundancias relativas de ácidos grasos insaturados en comparación con ácido hexanoico que es el ácido graso mayoritario. 80.00% 70.00% 60.00% Ácido cis-9- Hexadecenoico 50.00% Ácido trans?-9- 40.00% Hexadecenoico 30.00% Ácido Linoleico 20.00% 10.00% Ácido Oleico 0.00% Extracción por Extracción por Extracción Ácido 11-trans- sumersión en lavado con crioadhesiva Octadecenoico solvente solvente Método de extracción Figura 18. Abundancias relativas de ácidos grasos insaturados en comparación con ácido hexanoico que es el ácido graso mayoritario. 42 Porcentaje mayoritario 4.6 Triterpenoides Mediante todos los métodos de extracción los triterpenoides pentacíclicos fueron los compuestos predominantes en abundancia en comparación a los alcanos, alcoholes, ácidos grasos y aldehídos. Extracción Extracci Extracci Triterpeno por sumersión en ón por lavado ón crioadhesiva solvente con solvente Eicosahidropiceno 16,50% 65,94% 44,27% Octadecahidro-2H- picen-3-ona 17,35% 9,98% D:C-Friedoolean-8- en-3-ona 14,40% Lanosta-8,24-dien- 3-ona 100,00% 63,76% 42,42% D:A-Friedooleanan- 3-ol, (3α)- 95,94% 74,97% Friedelan-3-ona 47,45% 100,00% 100,00% Tabla 7. Abundancias de los triterpenos mayoritarios relativas al componente principal. 43 120.00% 100.00% Eicosahidropiceno 80.00% Octadecahidro-2H-picen-3- 60.00% ona D:C-Friedoolean-8-en-3-ona 40.00% 20.00% Lanosta-8,24-dien-3-one 0.00% Extracción Extracción Extracción D:A-Friedooleanan-3-ol, por por lavado crioadhesiva (3α)- sumersión con solvente Friedelan-3-ona en solvente Método de extracción Figura 19. Abundancias relativas de triterpenos comparadas por método de extracción. 4.7 Tocoferoles Se encontró α, γ y δ-tocoferol en las muestras extraídas con el método de sumersión en solvente. A pesar de que se observaron estos compuestos tanto en muestras derivatizadas con BSTFA como en las otras, se utilizaron las muestras derivatizadas para comparar las abundancias. El más abundante fue γ-tocoferol. 44 Porcentaje del mayoritario Extracción Extracción Tocoferoles por sumersión en por lavado con solvente solvente δ-Tocoferol 11% 3% γ-Tocoferol 41% 46% α-Tocoferol 20% 1% Ácido hexanoico 100% 100% Tabla 8. Abundancias relativas de tocoferoles en comparación con ácido hexanoico. 50% 45% 40% 35% 30% 25% δ-Tocoferol 20% γ-Tocoferol 15% 10% α-Tocoferol 5% 0% Extracción por sumersión Extracción por lavado con en solvente solvente Método de extracción Figura 20. Abundancias relativas de tocoferoles en función de ácido hexanoico. 4.8 Ceras totales Se decidió hacer la comparación de todos los grupos de ceras encontrados con la información obtenida de las muestras extraídas por sumersión en solvente debido a la mayor variedad de compuestos observados en ellas. Los triterpenoides representaron la mayor concentración de ceras epicuticulares seguidos de alcoholes, ácidos grasos alcanos y aldehídos. 45 Porcentaje del mayoritario Figura 21. Abundancia relativa de ceras totales en función de la suma de todas las concentraciones. 46 5. Discusión 5.1 Material vegetal En un primer momento se pensó que la especie de Tangarana situada en la universidad agraria era distinta a la de los especímenes encontrados en la selva. Los individuos de “Tangarana alley” fueron identificados por personal del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional de San Marcos durante una visita a la Reserva Nacional de Tambopata como Triplaris americana mientras que los encontrados en la UNALM estaban etiquedados como Triplaris peruviana. La literatura indica que Triplaris americana y Triplaris peruviana son dos especies distintas con diferencias morfológicas (Brandbyge, 1986). Sin embargo, al hacer un análisis más detallado de la nervadura de las hojas y la química epicuticular de ambas especies se llegó la conclusión que probablemente los individuos de la UNALM estén mal etiquetados y que ambos grupos son de la misma especie. 5.2 Alcanos Todas las muestras analizadas presentaban alcanos saturados lineales. Los más abundantes resultaron ser alcanos mayores, especialmente n-hentriacontano, n- nonacosano y n-heptacosano. Este resultado se repitió en los tres métodos de extracción utilizados y por lo tanto garantiza que son compuestos ubicados en las capas más externas de la epicutícula. Se seleccionaron los mejores cromatogramas de cada método de extracción y se procedió a buscar e identificar los alcanos presentes en las mezclas. Para esto se buscó el característico patrón de espectro de masas de alcanos que consiste en un pico base [C H ]+4 9 (m/z = 57) fragmentos que incrementan en [C +4H9 + n(CH2)] y disminuyen 47 exponencialmente en abundancia. El fragmento de masa (m/z) más grande es la masa del alcano completo [M]+ y posee una abundancia ligeramente mayor que los fragmentos adyacentes. Una vez identificados los espectros, se procedió a confirmar la longitud de la cadena mediante el índice de Kovats. Figura 22. Espectro de masas de n-hentriacontano C31H64. Nótese el patrón característico de las masas de los fragmentos de un alcano lineal. La presencia de alcanos de cadena larga en las ceras epicuticulares ha sido reportada previamente en otras especies y suele ser la clase de compuestos mayoritaria en las ceras epicuticulares vegetales (Buschaus y col., 2007). Además, los alcanos mayoritarios encontrados en este estudio están dentro del rango de tamaño reportado en literatura previa desde C25 a C35 (Jetter y col., 2001). La predominancia de las cadenas de carbono impares en comparación a las pares en este estudio ha sido previamente observada y está asociada a la ruta biosintética de alcanos a partir de ácidos grasos (ver Figura 9) (Eglinton y col., 1967; Bourdenx y col., 2011). 48 5.3 Ácidos grasos Los ácidos grasos fueron identificados mediante el análisis GC/MS de muestras previamente derivatizadas para conseguir a sustituyentes trimetilsilil en los grupos hidroxilo. De esta manera se mejora la estabilidad y se reduce la polaridad de móleculas como los ácidos grasos. Al igual que en el caso de los alcanos, los ácidos grasos fueron encontrados mediante los tres métodos utilizados en este estudio y, por lo tanto, queda claro que se encuentran en la epicutícula de la hoja y no dentro de ella. Los espectros de masas de los ácidos trimetilsililados son característicos en poseer los siguientes fragmentos mayoritarios: el pico base [C4H O + 9 2Si] (m/z = 117), [Si(CH ) OH]+3 2 (m/z = 75), [Si(CH ) + + 3 3] (m/z = 73), [C5H10O2Si] (m/z = 132) producido por rearreglo de McLafferty y [M – CH +3] . Todos los ácidos grasos fueron identificados con este patrón de fragmentación. Luego, se procedió a comparar los índices de Kovats de ácidos grasos separados en los cromatogramas con los reportados previamente en la base de datos del NIST para confirmar la extensión de los ácidos grasos. Figura 23. Espectro de masas de ácido n-octadecanoico. 49 En orden de abundancia, los ácidos grasos mayoritarios hallados en la superficie de Triplaris americana fueron C16, C18, y C14, sin embargo también se observaron C22, C24 y C26. Los ácidos grasos C16 y C18, son los productos de la lipogénesis de las plantas que luego son extendidos a cadenas entre C22 y C32 para luego convertirse en los compuestos alifáticos epicuticulares (Samuels y col., 2008), es decir de los alcanos, aldehídos y alcoholes encontrados en la presente investigación. La menor concentración de ácidos de cadenas largas frente a las cortas puede estar relacionado con el hecho que la ruta de los alcoholes primarios está directamente acoplada al proceso de elongación y por lo tanto no deberían de haber intermediarios de cadenas largas en concentraciones considerables. Además, la ruta de alcanos está en competencia por estos compuestos también, y colabora con la reducción de ácidos grasos de cadenas muy largas Además de los ácidos grasos saturados encontrados, se observaron derivados insaturados de los homólogos C16 y C18, de los cuales, los más abundantes fueron ácido oleico y linoleico. La identificación de estos compuestos se llevó a cabo mediante la comparación de los espectros de masa con otros provistos por la base de datos del NIST. El análisis de estos compuestos se realizó a partir de las muestras derivatizadas por BSTFA. Estos compuestos han sido reportados previamente en ceras epicuticulares como esteres de terpenos (Gültz y col., 1987; Bianchi y col., 1993). 5.4 Alcoholes Los alcoholes al igual que los ácidos grasos poseen grupos hidroxilo que les proporciona una polaridad muy alta que dificulta el proceso de separación por cromatografía debido a las interacciones con la fase estacionaria y la dificultad de volatilización. Por esta razón, los extractos de ceras epicuticulares de Triplaris americana 50 fueron derivatizados con BSTFA para trimetilsililar estos grupos y conseguir lecturas más fiables. Luego, la identificación de los alcoholes primarios presentes en los cromatogramas se llevó a cabo mediante el análisis de espectros de masas. Los alcoholes trimetilsililados producen un patrón característico de fragmentación que nos permite identificar tanto la naturaleza del alcohol como también su extensión. El pico base del espectrograma pertenece al fragmento [M – CH ]+3 , que es el resultado de la pérdida de un metilo del grupo trimetilsilano. El segundo fragmento más importante es [Si(CH3- ) + +2OH] (m/z = 75) y finalmente el tercer fragmento es [Si(CH3)2OCH2] (m/z = 103). Figura 24. Espectro de masas de 1-trimetilsiloxy-hexacosano. Los alcoholes observados mayoritarios son C30, C28 y C26 en orden de abundancia. Esta observación, junto con la observación de ácidos grasos y alcanos, resulta estar de acuerdo con las rutas biosintéticas de ceras alifáticas epicuticulares. Una vez terminada la elongación de ácidos grasos, estos son reducidos primero a aldehídos y luego a alcoholes mediante una reacción enzimática que todavía no se encuentra totalmente elucidada (Samuels y col., 2008). 51 5.5 Aldehídos Los aldehídos fueron analizados sin derivatizar de muestras provenientes de los tres métodos de extracción. A diferencia de las otras clases de compuestos, los aldehídos parecieron estar presentes en menores concentraciones que alcoholes, ácidos grasos y alcanos. Como ya se ha mencionado, estudios previos sugieren que los aldehídos son intermediarios en la ruta biosintéticas de alcanos y alcoholes primarios a partir de ácidos grasos (Samuels y col., 2008). Esto se confirma debido a que, nuevamente, se observaron aldehídos homólogos de C30, C28 y C26 en mayor abundancia. La ionización electrónica para la espectrometría de masas produce una fragmentación típica de aldehídos que consiste en 5 picos importantes (m/z = 43, 57, 82, 96 y M – 14). El fragmento dependiente de la longitud del compuesto es [M – H2O] +. Esta información fue utilizada para identificar los aldehídos presentes en la muestra. A diferencia de todas las otras clases de compuestos estudiadas en este trabajo, la base de datos de espectros de masas del NIST no tiene información espectroscópica de aldehídos mayores a C24 razón por la cual no se pudo comparar los espectros de masas de los compuestos encontrados. Es necesario confirmar la naturaleza de los aldehídos encontrados en este estudio, próximamente, mediante la comparación de espectros de masas con estándares sintetizados a partir de alcanoles primarios (Hansjakob y col., 2010). 52 Figura 25. Espectro de masas de tetracosanal. Por otro lado, la separación de aldehídos por GC suele ser pobre ya que los picos del cromatograma no se definen muy bien e interfieren con los de otros compuestos parecidos. Por esta razón, es común derivatizar las muestras de aldehídos previamente. Normalmente se utilizan derivatizaciones con dimetilacetal y PFBHA (Berdyshev y col., 2010). Esto también debe ser tomado en cuenta en próximos estudios de este tipo. 5.6 Triterpenoides Los triterpenoides fueron los compuestos más variados y mayoritarios en el presente estudio. Esto fue un problema por dos razones. Primero, la cantidad y variedad de estos compuestos interfirió fuertemente con otros compuestos presentes en la mezcla de ceras y por lo tanto muchos picos del cromatograma fueron muy poco puros. Por otra parte, muchos de los triterpenos pentacíclicos tienen diferencias estructurales muy pequeñas entre sí lo que hace muy difícil su identificación únicamente por espectrometría de masas. Es necesaria una separación previa de estos compuestos para analizarlos independientemente del resto. Además, hacen falta métodos de análisis más específicos 53 para resolución de estas estructuras como RMN (Vlahov y col). La identificación de estructuras en este estudio se llevó a cabo únicamente mediante la comparación de espectros de masa con los recopilados en la base de datos del NIST. No se pudo hacer una comparación con estándares y por lo tanto la identificación es solamente referencial utilizando identificaciones con R. Match mayores a 500 y picos con purezas a partir de 15. A pesar de esto, hay 6 compuestos predominantes presentes en las muestras analizadas que pudieron ser parcialmente identificadas por comparación con la base de datos NIST con valores de comparación entre 600 y 900. Especialmente, los compuestos con mayor puntaje fueron Friedelan-3-ona (~900), D:C-Friedoolean-8-en-3- ona (~820) Lanosta-8,24-dien-3-ona (~800), 4,4,6a,6b,8a,11,11,14b-Octametil- 1,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,14,14a,14b-octadecahidro-2H-picen-3-onae (~880) y 2,2,4a,6a,8a,9,12b,14a-Octametil- 1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,12,12a,12b,13,14,14a,14b-eicosahidropiceno (~850). El perfil de compuestos alifáticos (alcanos, alcoholes, ácidos grasos y aldehídos) encontrados en Triplaris americana es muy similar al de composiciones de ceras de otras especies reportadas en la literatura (Samuels y col., 2008; Buschhaus y col., 2007; Müller y Riederer, 2005). Sin embargo, la variedad y abundancia de triterpenos es mayor a la reportada normalmente en otras especies como se puede observar en los resultados. Hay, sin embargo, ejemplos de ceras epictuticulares con altas concentraciones de triterpenoides, como en los olivos, y algunos cítricos que, sin embargo, no poseen asociaciones con hormigas. En ellos se han encontrado compuestos como Friedelan-3- ona que hemos visto muy abundantemente en las ceras de Triplaris americana en el presente estudio (Bianchi y col., 1993; Gültz y col., 1987). Esta característica fuera de lo común, puede estar relacionada con las interacciones de Triplaris americana con 54 Pseudomyrmex triplarinus. Artículos anteriores aseveran que, por ejemplo, las ceras epicuticulares del género Macaranga de plantas mirmecofitas poseen altas concentraciones de triterpenoides y que, probablemente, esto favorezca a una especie de hormigas (Markstädter y col., 2000). Por otro lado, no queda totalmente clara la especificidad de la locación de los triterpenoides encontrados a la epi o intra cutícula. Hace falta estudiar esto, mediante la comparación entre métodos mecánicos y químicos de extracción. La literatura sugiere que los compuestos triterpenoides están comúnmente concentrados en la intracutícula de las plantas y que su presencia en la epicutícula suele ser observada en menor medida (Buschhaus y col., 2007; Buschhaus y col., 2011). 5.7 Tocoferoles Los tocoferoles fueron identificados por espectrometría de masas e índices de retención. Los espectros de masas poseen dos fragmentos característicos en los tocoferoles: [M]+ y otro que está formado por el anillo bencénico con sus respectivos metilos, el grupo trimetilsiloxi y parte del segundo anillo oxigenado. Se pudieron identificar correctamente α y δ-tocoferol ya que difieren en masa entre si y de β y γ- tocoferol. Sin embargo, β y γ-tocoferol solo varían en la posición de un metilo en el anillo bencénico. Es necesario un estudio de RMN para confirmar su estructura. 55 Figura 26. Espectro de masas de trimetilsilil-α-tocoferol. 56 6. Conclusiones Primero, se logró caracterizar cualitativamente la composición de homólogos de 4 clases fundamentales de compuestos alifáticos de cadenas largas en las ceras epicuticulares de Triplaris americana. Se pudo observar las características cadenas impares en alcanos y pares en alcoholes primarios, ácidos grasos y aldehídos. Además, las extensiones más abundantes de estos compuestos fueron coherentes con los resultados publicados en la literatura sobre ceras epicuticulares (Samuels y col., 2008; Bourdenx y col., 2011). Por otro lado, la implementación de distintos métodos de extracción produjo una diferencia importante en los resultados obtenidos. Esto fue corroborado con la literatura (Jetter y col., 2001) y, por lo tanto, se llegó a la conclusión de que para aumentar la selectividad de extracción a capas más superficiales de la epicutícula es necesario abandonar los métodos de extracción por solvente a favor de los métodos mecánicos como la extracción crioadhesiva y extracción con adhesivos como goma arábica (Markstädter y col., 2000; Riedel y col., 2003). Sin embargo, las extracciones con solvente revelan información crucial sobre la química de capas más profundas, como las ceras intracuticulares. Con respecto a los triterpenoides hallados en las ceras epicuticulares, es importante notar que las estructuras están sugeridas en base a las identificaciones con la base de datos del NIST. Sin embargo, es preciso ampliar el estudio de los triterpenoides presentes en las ceras epicuticulares de Triplaris americana para confirmar completamente su estructura. Se sugiere una etapa previa de extracción en solvente y cromatografía de columna, además de modificaciones en el método cromatográfico para lograrlo. Asimismo, debido a la similidaridades entre terpenoides, es necesario complementar esta con otras técnicas analíticas, como RMN, para una correcta 57 identificación de compuestos. Como se ha discutido, los triterpenoides muy probablemente estén relacionados con las interacciones planta-hormiga entre Triplaris amerciana y Pseudomyrmex triplarinus, y, por lo tanto, son especialmente interesantes en esta línea de investigación. 58 7. Bibliografía Augusto, F., Pires Valente, A. L. (2002). 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